Een cel cultuur Model van weerstand slagaders
Summary
Een cel cultuur model van weerstand slagaders wordt beschreven, waardoor de dissectie van signalering van trajecten in endotheel, gladde spieren, of tussen endotheel en gladde spieren (de kruising van de myoendothelial). De selectieve toepassing van agonisten of eiwit isolatie, elektronenmicroscopie of immunofluorescentie kan worden gebruikt met behulp van deze cel cultuur model.
Abstract
Het myoendothelial junction (MEJ), een unieke signalering microdomain in kleine diameter weerstand slagaders, vertoont lokalisatie van specifieke proteïnen en signalering processen die vasculaire Toon en bloeddruk kunnen. Als het is een projectie van hetzij de cel endothelial of gladde spieren, en als gevolg van zijn kleine formaat (gemiddeld een oppervlakte van ~ 1 µm2), de MEJ is moeilijk om te studeren in afzondering. Echter hebben we een cel cultuur model genaamd de vasculaire co celcultuur (VCCC) waarmee in vitro MEJ vorming, endothelial cel polarisatie en dissectie van signalering eiwitten en processen in de vasculaire muur van verzet slagaders. De VCCC heeft een veelheid van toepassingen en kan aangepast worden aan verschillende soorten cellen. Het model bestaat uit twee celtypen gegroeid aan weerszijden van een filter met 0.4 µm poriën waarin de in vitro MEJs kunnen vormen. Hier beschrijven we hoe maak je de VCCC via beplating van cellen en isolatie van endotheel, MEJ, en glad spierweefsel fracties, die vervolgens kunnen worden gebruikt voor isolatie van de eiwit- of activiteit testen. Het filter met intact cel lagen kan worden opgelost, ingesloten en verdeelde immunefluorescentie p.a.. Nog belangrijker is, zijn veel van de ontdekkingen van dit model bevestigd met behulp van intact weerstand slagaders, de fysiologische relevantie onderstrepen.
Introduction
In kleine diameter weerstand slagaders scheidt een dunne interne elastische lamina (IEL) endothelial (EG) en de zachte spiercellen (SMC). De cellen kunnen project door openingen in deze elastische matrix en leveren van directe cytoplasmatische verbindingen via gap junction kanalen1,2. Deze unieke structuur is de myoendothelial kruising (MEJ) genoemd. De MEJ is een klein (ongeveer 0,5 µm x 0,5 µm, afhankelijk van het vasculaire bed), cellulaire projectie bestaat voornamelijk uit endotheliale cellen, maar kan voortkomen uit gladde spieren ook3,4. Een aantal onderzoekers hebben aangetoond dat de enorme complexiteit van de netwerken die zich selectief bij de MEJ voordoen, waardoor zij een bijzonder belangrijke locatie voor het vergemakkelijken van de bi-directionele signalen tussen endotheel en gladde spieren5 signalering ,6,7,8,9,10.
Een mechanistische dissectie van signaalroutes op de MEJ is echter moeilijk in een intact slagader. Omdat de MEJ een cellulaire projectie is, is het momenteel niet mogelijk om te isoleren een in vivo MEJ van de vasculaire muur. Om deze reden werd de VCCC model1 ontwikkeld. Nog belangrijker is, de VCCC repliceert fysiologische endothelial morfologie11 en polarisatie van de signalen tussen de apicale en MEJ gedeelten van de cel-12. Het was dit unieke model, dat de ontdekking dat alfa hemoglobine in de endothelial cel vergemakkelijkt is, gepolariseerde aan de MEJ. Dit is in tegenstelling tot conventioneel gekweekte endotheliale cellen die niet Alfa hemoglobine13 uitdrukken doen. Voor onderzoekers microvasculaire endotheel kochten, kan het dienstig meer gebruik van endotheliale cellen die hebben zijn gekweekt in de VCCC, vooral als de bedoeling is om te ontleden signaalroutes die zich in een kleine diameter weerstand slagaders voordoen.
Met behulp van een stevige plastic invoegen met een filter met een kleine diameter poriën (0.4 µm in diameter) te co cultuur twee verschillende celtypes voorkomt dat de cellen migreren tussen lagen. Het resulteert in een 10 µm-afstand tussen de cellen, die is aanzienlijk langer dan in vivo, maar nog steeds wordt gerepliceerd veel van de in-vivo -kenmerken van MEJs, waaronder eiwitten lokalisatie en tweede messenger signalering1 , 14. verder de VCCC staat voor het targeten van cel type-specifieke signalering via de toevoeging van een agonist of -antagonist tot de specifieke cellulaire compartiment. Bijvoorbeeld, laden van de EG met BAPTA-AM aan chelaat de calcium, en het stimuleren van de SMC met phenylephrine14. In tegenstelling tot andere beschrijvingen van co cultuur modellen15,16,17,18,19,20,21biedt dit instructies over het isoleren van de verschillende fracties voor mRNA en eiwit, met inbegrip van de verschillende MEJ breuk binnen de poriën van het filter. De toevoeging van deze techniek aan de VCCC voorziet in specifieke onderzoek naar veranderingen in mRNA lokalisatie of transcriptie22, proteïne fosforylatie12,23, en eiwit activiteit12. Dit artikel beschrijft plating van EG bovenop de filter en SMC op de bodem, hoewel het mogelijk is om de cultuur van de twee celtypes in verschillende conformaties11,18,24.
Protocol
Representative Results
Discussion
De VCCC heeft een aantal voordelen in termen van Recapitulerend MEJs in vitro, maar er zijn punten van discussie bij de vaststelling als de VCCC kan worden gebruikt voor specifieke toepassing. Bijvoorbeeld, als verschillende soorten cellen zijn voor gebruik met dit model, zal het moeten worden geoptimaliseerd. We hebben gebruik gemaakt van primaire menselijke cellen, maar het is mogelijk te isoleren van de cellen van boviene aortas24, of wildtype of knock-out muizen, en gebruik ze in de V…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de National Heart, verleent Lung and Blood Institute R01088554, de T32HL007284 en de American Heart Association predoctoraal fellowship 14PRE20420024. Wij bedanken met name de St. Jude cellulaire Imaging gedeeld onderzoek kern, met inbegrip van Randall Wakefield en Linda Horner voor de beelden van elektronenmicroscopie, Adam Straub voor hulp bij representatieve immunofluorescentie beelden en Pooneh Bagher voor haar waardevolle feedback over het manuscript-protocol.
Materials
| 24mm diameter, 0.4µm Transwell Polyester membrane filter insert | Corning | 3450 | This is one 6 well plate of inserts |
| 225cm2 flask | Corning | 431082 | |
| 6 well plates (without filter inserts) | Corning | 3506 | |
| Primary human coronary artery endothelial cells | Lonza | CC-2585 | |
| Primary human coronary artery smooth muscle cells | Lonza | CC-2583 | |
| EBM-2 EC Basal media | Lonza | CC-3156 | |
| EC growth factors (EGM2 MV Single quots) | Lonza | CC-4147 | Add to basal media before use |
| SmBM SMC basal media | Lonza | CC-3181 | |
| SMC growth factors (SmGM-2 SingleQuot) | Lonza | CC-4149 | Add to basal media before use |
| 0.5% Trypsin-EDTA 10X | Gibco | 15400-054 | Dilute to 2X with sterile dPBS |
| Hemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| large petri dishes for SMC Plating (150mm) | Corning | 353025 | |
| Bovine gelatin | Sigma | G-9382 | |
| Human fibronectin | Corning | 356008 | 5µg/ml of fibronectin and store at -20 |
| 10X Hanks' Buffered salt solution (HBSS) | Gibco | 14065-056 | Dilute to 1x with sterile water |
| 10X Dulbecco's Phosphate buffered saline (dPBS) | Gibco | 14200-075 | Dilute to 1x with sterile water |
| Disposable Curved Scalpel (30mm cutting edge) with handle | Amazon | MDS15210 | |
| Forceps | Fisher | 17-467-201 | |
| Cell lifter | Corning | 3008 | |
| Cell scraper | BD Falcon | 353085 | |
| 50mL conical tube | Corning | 352070 | |
| 10mm petri dishes | Falcon | 35-1008 | |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| RNA lysis reagent | Qiagen | 79306 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | Make 4% solution with dPBS |
| 70% ethanol | Fisher | 04-355-305 | |
| Cavicide disinfectant | Fisher | 131000 | |
| RIPA protein lysis buffer | Sigma | R0278 | |
| Sonic dismembranator | Fisher | Model 50 | |
| 1X PBS for harvesting EC/SMC and immunocytochemistry | Gibco | 10010023 | does not need to be sterile |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Embedding/Sectioning/Staining | |||
| Paraffin | Fisher | P31-500 | |
| Automated tissue processer | Excelsior | ES | |
| Embedding station + cold plate | Leica | HistoCore Arcadia | |
| Tissue Tek Accu-Edge Microtome blade | VWR | 25608-961 or 25608-964 | |
| Microscope slides | Thermo Fisher | 22-230-900 | |
| Coverslips | Thermo Fisher | 12-548-5E | |
| Prolong Gold mounting medium | Thermo Fisher | P36931 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other Solutions | **Perform all steps in sterile conditions if using the solution on live cells | ||
| Sterile dPBS | Autoclave water to sterilize. Using the sterile water make DPBS (450mL sterile water: 50mL 10X DPBS), mix and filter sterilize (0.2µm filter). Final concentration: 1X |
||
| sterile HBSS | Autoclave water to sterilize. Using the sterile water make HBSS (450mL sterile water: 50mL 10X HBSS), mix and filter sterilize (0.2µm filter). Final concentration: 1X |
||
| Fibronectin stock solution | Use 50mL of sterile water to fibronectin to make stock of 1mL aliquots, then freeze until needed Final concentration: 100µg/mL |
||
| Fibronectin to coat SMC side of VCCC | thaw one aliquot and add 1mL of fibronectin (100µg/mL) to 19mLs of 1X HBSS to reach a final concentration of 5µg/mL. Final concentration: 5µg/mL |
||
| 2x Trypsin EDTA solution | Dilute the 10X 0.5% Trypsin-EDTA to 2X with 1X dPBS (40mL DPBS: 10mL 10X Trypsin) . Final concentration: 2X |
||
| Blocking/antibody solution | (9mL 1X PBS, 25mL Triton X100, 50mg bovine serum albumin, 500mL normal serum) | ||
| Bovine gelatin to coat EC VCCC | Mix 0.5g bovine gelatin into 100mL distilled water. Autoclave prior to first use and store at room temperature. Keep in sterile conditions. Final concentration: 0.50% |
||
| 1X PBS for harvesting cells | does not need to be sterile |
References
- Isakson, B. E., Duling, B. R. Heterocellular contact at the myoendothelial junction influences gap junction organization. Circ Res. 97 (1), 44-51 (2005).
- Little, T. L., Xia, J., Duling, B. R. Dye tracers define differential endothelial and smooth muscle coupling patterns within the arteriolar wall. Circ Res. 76 (3), 498-504 (1995).
- Heberlein, K. R., Straub, A. C., Isakson, B. E. The myoendothelial junction: breaking through the matrix?. Microcirculation. 16 (4), 307-322 (2009).
- Straub, A. C., Zeigler, A. C., Isakson, B. E. The myoendothelial junction: connections that deliver the message. Physiology (Bethesda). 29 (4), 242-249 (2014).
- Isakson, B. E., Ramos, S. I., Duling, B. R. Ca2+ and inositol 1,4,5-trisphosphate-mediated signaling across the myoendothelial junction. Circ Res. 100 (2), 246-254 (2007).
- Dora, K. A., Doyle, M. P., Duling, B. R. Elevation of intracellular calcium in smooth muscle causes endothelial cell generation of NO in arterioles. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (12), 6529-6534 (1997).
- Sonkusare, S. K., et al. Elementary Ca2+ signals through endothelial TRPV4 channels regulate vascular function. Science. 336 (6081), 597-601 (2012).
- Ledoux, J., et al. Functional architecture of inositol 1,4,5-trisphosphate signaling in restricted spaces of myoendothelial projections. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9627-9632 (2008).
- Boerman, E. M., Everhart, J. E., Segal, S. S. Advanced age decreases local calcium signaling in endothelium of mouse mesenteric arteries in vivo. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 310 (9), H1091-H1096 (2016).
- Toussaint, F., Charbel, C., Blanchette, A., Ledoux, J. CaMKII regulates intracellular Ca(2)(+) dynamics in native endothelial cells. Cell Calcium. 58 (3), 275-285 (2015).
- Truskey, G. A. Endothelial Cell Vascular Smooth Muscle Cell Co-Culture Assay For High Throughput Screening Assays For Discovery of Anti-Angiogenesis Agents and Other Therapeutic Molecules. Int J High Throughput Screen. 2010 (1), 171-181 (2010).
- Biwer, L. A., et al. Two functionally distinct pools of eNOS in endothelium are facilitated by myoendothelial junction lipid composition. Biochim Biophys Acta. 1861 (7), 671-679 (2016).
- Straub, A. C., et al. Endothelial cell expression of haemoglobin alpha regulates nitric oxide signalling. Nature. 491 (7424), 473-477 (2012).
- Isakson, B. E. Localized expression of an Ins(1,4,5)P3 receptor at the myoendothelial junction selectively regulates heterocellular Ca2+ communication. J Cell Sci. 121 (Pt 21), 3664-3673 (2008).
- Axel, D. I., et al. Induction of cell-rich and lipid-rich plaques in a transfilter coculture system with human vascular cells. J Vasc Res. 33 (4), 327-339 (1996).
- Hastings, N. E., Simmers, M. B., McDonald, O. G., Wamhoff, B. R., Blackman, B. R. Atherosclerosis-prone hemodynamics differentially regulates endothelial and smooth muscle cell phenotypes and promotes pro-inflammatory priming. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (6), C1824-C1833 (2007).
- Herzog, D. P., Dohle, E., Bischoff, I., Kirkpatrick, C. J. Cell communication in a coculture system consisting of outgrowth endothelial cells and primary osteoblasts. Biomed Res Int. , 320123 (2014).
- Jacot, J. G., Wong, J. Y. Endothelial injury induces vascular smooth muscle cell proliferation in highly localized regions of a direct contact co-culture system. Cell Biochem Biophys. 52 (1), 37-46 (2008).
- Scott-Drechsel, D., et al. A new flow co-culture system for studying mechanobiology effects of pulse flow waves. Cytotechnology. 64 (6), 649-666 (2012).
- van Buul-Wortelboer, M. F., et al. Reconstitution of the vascular wall in vitro. A novel model to study interactions between endothelial and smooth muscle cells. Exp Cell Res. 162 (1), 151-158 (1986).
- Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (1), 113-128 (2011).
- Heberlein, K. R., et al. A novel mRNA binding protein complex promotes localized plasminogen activator inhibitor-1 accumulation at the myoendothelial junction. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (5), 1271-1279 (2012).
- Straub, A. C., et al. Compartmentalized connexin 43 s-nitrosylation/denitrosylation regulates heterocellular communication in the vessel wall. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (2), 399-407 (2011).
- Cucina, A., et al. Vascular endothelial growth factor increases the migration and proliferation of smooth muscle cells through the mediation of growth factors released by endothelial cells. J Surg Res. 109 (1), 16-23 (2003).
- Heberlein, K. R., et al. Plasminogen activator inhibitor-1 regulates myoendothelial junction formation. Circ Res. 106 (6), 1092-1102 (2010).
- Isakson, B. E., Best, A. K., Duling, B. R. Incidence of protein on actin bridges between endothelium and smooth muscle in arterioles demonstrates heterogeneous connexin expression and phosphorylation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294 (6), H2898-H2904 (2008).
- Biwer, L. A., Isakson, B. E. Endoplasmic reticulum-mediated signalling in cellular microdomains. Acta Physiol (Oxf). 219 (1), 162-175 (2017).
