Bir Yetişkin Sıçan Kalpten Yüksek Kalitede Kardiyomiyosit, Endotel Hücresi ve Fibroblastların Eşzamanlı İzolasyonu
Summary
Bir fare kalpten farklı kardiyak hücre tiplerinin izolasyonu için çeşitli protokoller geliştirilmiş ve açıklanmıştır. Burada, yüksek kaliteli ana kardiyak hücre tiplerinin (kardiyomiyosit, endotel hücreleri ve fibroblastların) tek bir preparasyondan izole edilmesini sağlayan deneysel maliyetleri düşüren optimize edilmiş bir protokol tarif edilmiştir.
Abstract
Sıçan, kardiyovasküler araştırmalarda kullanılan önemli bir hayvan modelidir ve fare kalp hücreleri, kalp hipertrofisi, fibroz ve ateroskleroz gibi kardiyovasküler hastalık ilerlemesinin moleküler mekanizmalarının in vitro analizi için rutin olarak kullanılmaktadır. Bu hücresel mekanizmaları anlamak için kardiyovasküler sistemden ölümsüzleştirilmiş hücre hatları geliştirmek için değişken başarı ile çeşitli girişimler yapılmış olsa da, primer hücreler bu çalışmalar için daha doğal ve canlı ortamda çevreye yakınlık sağlar. Bu nedenle, belirli bir hücre tipinde çalışan farklı laboratuvarlar, ilgili fare kalp hücrelerinin bireysel tiplerini izole etmek için protokoller geliştirmiştir. Bununla birlikte, birden fazla hücre türünün izolasyonunu sağlayan bir protokol eksiktir. Burada, yüksek kalitede büyük kardiyak hücre tiplerinin (kardiyomiyosit, endotel hücreleri ve fibroblastların) tek bir preparasyondan izole edilmesini sağlayan ve bir preparasyondanH hücresel analizler için kullanın. Bu, kullanılabilir kaynaklardan en verimli şekilde yararlanılmasına izin verir; bu da zaman kazandırabilir ve araştırma maliyetlerini düşürebilir.
Introduction
Kemirgen modelleri, sağlık ve hastalıkta kardiyovasküler fizyoloji konusundaki anlayışımızı genişletmek için uzun zamandır araç olarak kullanılmıştır. 1 Bu hayvan modelleri, bir hastalığın organ seviyesinde patofizyolojisini anlamamıza ve kardiyovasküler hastalıkların tedavisinde kullanılan çeşitli farmakolojik ajanların farmakokinetik ve farmakodinamiklerini analiz etmemize, kardiyovasküler hastalık gelişiminin moleküler mekanizmalarının anlaşılmasına ve belirli bir hastalığa katkıda bulunmamıza izin vermesine rağmen Hücre tipi, in vitro hücre kültürü modellerinin kullanılmasını gerektirir. Bu amaçla kardiyovasküler sistemden farklı ölümsüzleştirilmiş hücre hatları geliştirilmiştir; Bununla birlikte, yeni izole edilen primer hücreler, canlı dokular ve organizmalar için fizyolojik ve fonksiyonel açıdan daha alakalıdır.
Kalp, kardiyovasküler sistemin tüm önemli hücrelerini içeren çok yönlü bir organtır.Ystem ve sıçan kalbi halen kardiyovasküler fizyolojinin anlaşılması için yaygın olarak kullanılan bir model. Son birkaç on yıl boyunca, tek tek hücre tiplerinin kalp dokusunda izole edilmesi için farklı yöntemler tanımlanmıştır; Bununla birlikte, bu yöntemler yalnızca belirli bir hücre türünün izolasyonuna odaklanır, bu nedenle artık hücresel analiz için kullanılmayan diğer hücrelerin kaybına neden olur. Burada, kardiyak doku, yani kardiyomiyositler, endotel hücreleri ve fibroblastların majör hücre tiplerinin eşzamanlı ve yüksek kalitede izolasyonunu sağlayan optimize edilmiş bir protokol anlatılmıştır. Bu hücre tiplerinin hepsi farklı deneysel kurulumlarda 8 , 9 , 10 ve aynı hayvantan hücre-hücre etkileşimlerinin analizi için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makalede, kardiyak miyositlerin, endotel hücrelerinin ve fibroblastların izolasyonu ve kültürü için tekrarlanabilir bir protokol anlatılmıştır. Bu protokol, sadece bir hücre türünün aksine, kardiyomiyosit, endotel hücreleri ve fibroblastlar gibi kardiyak doku majör hücre tiplerinin eşzamanlı ve yüksek kalitede izolasyonunu tanımlar. İzolasyon prosedüründe kritik bir adım, kalp dokusunun doğru sindirilmesidir. Sindirim tamamlanmazsa, çok sayıda miyosit elde edilebilir ancak kalitesi çok za…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L. Rinaldi, S. Schäffer, D. Reitz, H. Thomas ve A. Weber'in teknik desteği minnettarlıkla kabul edilmektedir. Yazarlar, el yazmalarının derin kanıtı okuma ve dil düzenlemesi için Dr. E. Martinson'a teşekkür etmek istiyorlar. Çalışma, M. Aslam ve D. Gündüz'e verilen Giessen Anschubsfinanzierung Üniversitesi tarafından desteklendi.
Materials
| anti-vWF | Santa Cruz Biotech. | SC-14014 | |
| Calcium chloride | Merck | 102378 | |
| Carnitin | Sigma-Aldrich | C0283 | |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | |
| Creatin | Sigma-Aldrich | C0780 | |
| D-Glucose | Merck | 108342 | |
| Dil-Ac-LDL | Thermo Scientific | L3484 | |
| EDTA Solution (0.2 M) | Biochrome AG | L2113 | |
| Embeding solution | Citiflour | AF1-25 | |
| Endothelial cell medium MV2 | PromoCell | C-22022 | |
| Foetal calf serum (FCS) | Biochrome AG | S0615 | |
| Gentamicin | Serva Chemicals | 47991 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| Isoflurane | Abbott | TU 061219 | |
| Laminin | Roche/Sigma | 11243217001 | |
| M199 medium | Thermo Scientific | 11150059 | |
| M199 medium (Powder) | Biochrome AG | T061 | |
| Magnesium sulphate | Sigma-Aldrich | 63138 | |
| Mouse anti-rat CD31 antibody (TLD-3A12) | Thermo Scientific | MA1-81051 | |
| NaCl solution (0.9%), Sterile | B. Braun | 30820080 | |
| Pan mouse IgG beads (Dynabeads) | Thermo Scientific | 11041 | |
| Paraformaldehyde (PFA) 4% Solution | Santa Cruz Biotech. | sc-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Scientific | 15070-063 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) 1x | PAN-Biotech | P04-36500 | |
| Plastic consumables | Greiner Bio-One | ||
| Potassium Chloride | Merck | 4933 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 7873 | |
| Sodium Chloride | Merck | 6404 | |
| Sodium Hydroxide Solution (2 N) | Merck | 109136 | |
| Sterile filtration system | Thermo Scientific | 5660020 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| TO-PRO | Thermo Scientific | T3605 | |
| Trypsin-EDTA Solution (10X) | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| Water, Sterile | B. Braun |
References
- Zaragoza, C., et al. Animal models of cardiovascular diseases. J Biomed Biotechnol. 2011, 497841 (2011).
- Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (6), 2979-2984 (1998).
- Barbieri, S. S., Weksler, B. B. Tobacco smoke cooperates with interleukin-1beta to alter beta-catenin trafficking in vascular endothelium resulting in increased permeability and induction of cyclooxygenase-2 expression in vitro and in vivo. FASEB J. 21 (8), 1831-1843 (2007).
- Piper, H. M., Probst, I., Schwartz, P., Hutter, F. J., Spieckermann, P. G. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J Mol Cell Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).
- Xu, X., Colecraft, H. M. Primary culture of adult rat heart myocytes. J Vis Exp. (28), (2009).
- Gündüz, D., et al. Accumulation of extracellular ATP protects against acute reperfusion injury in rat heart endothelial cells. Cardiovasc.Res. 71 (4), 764-773 (2006).
- Brilla, C. G., Zhou, G., Matsubara, L., Weber, K. T. Collagen metabolism in cultured adult rat cardiac fibroblasts: response to angiotensin II and aldosterone. J Mol Cell Cardiol. 26 (7), 809-820 (1994).
- Shahzad, T., et al. Mechanisms involved in postconditioning protection of cardiomyocytes against acute reperfusion injury. J Mol Cell Cardiol. 58, 209-216 (2013).
- Gündüz, D., et al. Insulin Stabilizes Microvascular Endothelial Barrier Function via Phosphatidylinositol 3-Kinase/Akt-Mediated Rac1 Activation. Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol. 30, 1237-1245 (2010).
- Lipps, C., et al. N-terminal fragment of cardiac myosin binding protein-C triggers pro-inflammatory responses in vitro. J Mol Cell Cardiol. 99, 47-56 (2016).
- Abdallah, Y., et al. Interplay between Ca2+ cycling and mitochondrial permeability transition pores promotes reperfusion-induced injury of cardiac myocytes. J Cell Mol Med. 15 (11), 2478-2485 (2011).
- Gündüz, D., et al. Effect of ticagrelor on endothelial calcium signalling and barrier function. Thromb Haemost. , (2016).
- Gündüz, D., et al. Opposing effects of ATP and adenosine on barrier function of rat coronary microvasculature. J Mol.Cell Cardiol. , (2012).
