Оценка процедуры выполнения пробуждения цистометрии в мышиной модели
Summary
В этом исследовании описываются хирургические процедуры и экспериментальные методы для проведения активной цистометрии у свободно движущейся мыши. Кроме того, он предоставляет экспериментальные данные, подтверждающие его оптимизацию и стандартизацию.
Abstract
Цистометрия с активным заполнением была использована в течение длительного времени для оценки функции мочевого пузыря у свободно перемещающихся мышей, однако конкретные методы, используемые в разных лабораториях, различаются. Цель этого исследования состояла в том, чтобы описать микрохирургическую процедуру, используемую для имплантации внутрипузырной трубки, и экспериментальную методику для регистрации давления мочевого пузыря в бодрствующей свободно движущейся мыши. Кроме того, экспериментальные данные представлены, чтобы показать, как хирургия, а также тип и размер трубки влияют на функцию нижних мочевых путей и чувствительность к записи. Влияние диаметра трубы на запись давления оценивали как в полиэтиленовых, так и в полиуретановых трубах с различными внутренними диаметрами. Впоследствии лучшая пробирка из обоих материалов была хирургически имплантирована в купол мочевого пузыря самцов мышей C57BL / 6. Частота двенадцатичасовой ночной мочеиспускания регистрировалась у здоровых, интактных животных и животных через 2, 3, 5 и 7 дней после операции. При уборке, пузыри wОценивались по признакам набухания с использованием валового наблюдения и впоследствии обрабатывались для патологического анализа. Наибольшая набухаемость мочевого пузыря наблюдалась на 2-й и 3-й день, что коррелировало с данными по поведенческому мочеиспусканию, показывающими значительную нарушения функции мочевого пузыря. К 5 дню гистология мочевого пузыря и частота мочеиспускания нормализовались. Основываясь на литературе и доказательствах, полученных в наших исследованиях, мы предлагаем следующие шаги для регистрации in vivo внутрипузырного давления и объема мочеиспускания у бодрствующей мыши: 1) выполнить операцию с использованием операционного микроскопа и микрохирургических инструментов; 2) использовать полиэтилен-10 Чтобы уменьшить артефакты движения, и 3) выполнить цистометрию на 5-й день после операции, когда разбухание пузыря разрешится.
Introduction
Заполнение цистометрии (ФК) является диагностическим методом, который включает в себя размещение катетера в мочевом пузыре для регистрации давления во время медленной наполнения мочевого пузыря. Впервые введенный в 1927 году в качестве клинического диагностического метода для оценки функции нижних мочевых путей, он по-прежнему широко используется. 1 В исследованиях применение ФК может быть использовано для проверки функции мочевого пузыря у здоровых и больных животных моделей и для изучения эффектов фармакологических агентов. Грызунные животные модели обычно используются для исследования функции нижних мочевых путей. 2 В этой группе млекопитающих FC был впервые разработан для использования на крысах. 3 Здесь методика имплантации трубки в мочевой пузырь и выполнения ФК была хорошо описана и использована многими исследователями с приемлемым уровнем воспроизводимости. 4 Наличие трансгенных и выбитых штаммов делает мышей ценным видом для многочисленных исследовательских областей,Включая область дисфункции нижних мочевых путей. Методика, используемая для проведения мышиной цистометрии, значительно варьирует между лабораториями, что затрудняет сравнение результатов. 5
По сравнению с образцами ex vivo ФК сохраняет анатомию нижних мочевых путей, что позволяет координировать функцию между мочевым пузырем и его выходом во время фазы хранения и опорожнения цикла мочеиспускания. Предыдущие исследования показывают, что многочисленные, часто используемые анестетики подавляют сокращение мочеиспускания. Агенты, которые сохраняют сокращение гладкой мускулатуры мочевого пузыря (уретан, α-хлоралоза, кетамин и ксилазин), позволяя животному micturate, все еще значительно уменьшают функциональную емкость мочевого пузыря и подавляют нейротрансмиссию. 6 , 7 , 8 , 9 Хотя технически более сложная задача, ФК выполняется в awЖивотные, находящиеся в движении, сохраняют функциональную целостность рефлекса мочеиспускания.
На функции нижних мочевых путей влияют несколько факторов, включая послеоперационное опухание стенки мочевого пузыря, стресс из-за боли и дискомфорта и влияние окружающей среды. Используя хирургическую технику, которая минимизирует повреждение ткани во время имплантации трубки и методов регистрации, которые уменьшают движение трубки, одновременно позволяя животному свободно перемещаться, необходимы для получения точных и воспроизводимых записей.
Если выполнено адекватно, in vivo FC в свободно движущихся животных может предоставить данные, которые надежно отражают физиологическую функцию мочевого пузыря. 10 FC в свободно движущихся животных могут предоставить данные по следующим параметрам; Базальное или базовое давление: Минимальное давление между двумя мочеиспусканиями. Давление перетекания: среднее давление между двумя мочеиспусканиями. Пороговое давление: внутрипузырное давление immНепосредственно перед мочеиспусканием. Максимальное давление: Максимальное давление в мочевом пузыре во время цикла мочеиспускания. Спонтанная активность (или среднее колебательное давление): давление перетирания минус базальное давление. Невобождающиеся сокращения: увеличение внутрипузырного давления во время фазы заполнения, не связанное с выделением жидкости. Соответствие мочевого пузыря: емкость мочевого пузыря делится на пороговое давление минус базальное давление. Частота мочеиспускания: количество мочеиспусканий в единицу времени. Интервал между переменами: период между двумя максимальными давлениями опорожнения. Объем мочевого пузыря: Объем инфузии делится на количество мочеиспусканий. Ранее было опубликовано подробное описание этих параметров и стандартизированная терминология. 11
ФК может быть выполнена с использованием метода внутрипузырной инфузии с непрерывным или однократным циклом. Непрерывная цистометрия позволяет регистрировать несколько циклов мочеиспускания и выбирать репрезентативные данные на основеНа воспроизводимость. Его точность измерения емкости мочевого пузыря ограничена из-за неизвестного остаточного объема. Кроме того, сложно собирать маленькие свободные объемы (которые основаны на деформации и полу варьируют от 30 до 184 мкл) у свободно передвигающихся мышей. Использование этого метода для регистрации объема мочеиспускания является менее точным по сравнению с анестезированным препаратом, но оно превосходит его в том, что оно позволяет избежать подавляющих эффектов анестетиков на функцию мочевого пузыря. Для оценки емкости мочевого пузыря следует использовать одноциклическую цистометрию. В этом методе мочевой пузырь опорожняется путем аспирации до инфузии, а емкость рассчитывается как функция скорости инфузии, умноженной на время до максимального давления.
Хотя была опубликована методика проведения цистометрии у мелких грызунов, она описала операцию, выполненную на крысе, и рекомендовала провести цистометрию мыши под анестезией уретаном. 10 Цель этого сообщения – tO описать как микрохирургические методы, используемые для имплантации внутрипузырной трубки в купол мочевого пузыря, так и экспериментальную установку, используемую для регистрации функции нижних мочевых путей, in vivo , при непрерывном заполнении мочевого пузыря и мочеиспускании в бодрствующей свободно движущейся мыши. Кроме того, были проведены эксперименты по определению длины, диаметра и материала труб, а также методологии проведения in vivo FC, влияющих на запись. Этот экспериментальный протокол суммирует ранее опубликованные методы и предлагает ряд модификаций, основанных на экспериментальных результатах.
Protocol
Representative Results
Discussion
Оптимальный материал и размер внутрипузырной трубки
Для определения влияния диаметра трубки на запись давления мы тестировали различные микрожидкостные трубки; PE50 (0,58 мм ID), полиуретан PU027 (0,4 мм ID), PE25 (0,46 мм ID) и PE10 (0,28 мм ID). Для каждой трубки регистрировали давление с помощ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was funded by the Department of Surgery University of Vermont, Danish Council for Independent Research, and by the Odense University Hospital.
Materials
| Polyethylene (PE) 10 tubing | Instech | BTPE-10 | Fits 30G connectors/plugs |
| Polyethylene (PE) 50 tubing | Instech | BTPE-50 | Fits 22G connectors/plugs |
| 22ga single channel stainless steel swivel | Instech | 375/22 | |
| High Carbon Steel Utility Extension Spring (9/64" OD) | Grainger | 1NAH1 | Protects PE50 tubing – Cut to length |
| 22G connector | Instech | SP22/12 | |
| Yutaoz Professional Hot Melt Adhesive Glue Gun | Yutaoz | Use low temperature setting (100°C) – Any hot melt glue gun with an adjustable temperature range will work | |
| Surebonder DT-2010 all purpose glue stick | Surebonder | Any all purpose hot glue will work | |
| Dumont #5 curved microforceps | World Precision Instruments | 500232 | |
| Dumont #7 curved microforceps | World Precision Instruments | 14188 | |
| Mini dissecting scissors – straight | World Precision Instruments | 503240 | |
| Micro mosquito forceps (12.5cm) | World Precision Instruments | 500451 | |
| Dissecting scissors – straight | World Precision Instruments | 14393 | |
| Castroviejo Needle Holder | World Precision Instruments | 503258 | |
| Isoflurane, USP | Phoenix | 2%, 1 L/min flow rate | |
| Buprenorphine | 0.05mg/kg | ||
| 0.9% Sodium Chloride Irrigation, USP | Baxter | ||
| 6-0 Ethilon black monofilament, non-absorbable suture | Ethicon | Bladder tie | |
| 6-0 Vicryl violet braided, absorbable suture | Ethicon | Muscle suture, running | |
| 6-0 Prolene blue monofilament, non-absorbable suture | Ethicon | Skin suture, vertical mattress, buried interrupted | |
| KD Legato 210 infuse/withdraw pump | KD Scientific | 1.5ml/hr | |
| Disposable pressure transducer | Digitimer | NL108T2 | |
| Pressure Amplifier | Digitimer | NL108A | |
| Power1401-3 data acquisition interface | Digitimer | ||
| Spike2 | Cambridge Electronic Design Limited | PC pressure recording software | |
| Leica MZ6 surgical operating microscope (3.2-20X) | Leica Microsystems | Magnification |
References
- Perez, L. M., Webster, G. D. The History of Urodynamics. Neurourol Urodyn. 11 (1), 1-21 (1992).
- Fry, C. H., et al. Animal models and their use in understanding lower urinary tract dysfunction. Neurourol Urodyn. 29 (4), 603-608 (2010).
- Maggi, C. A., Santicioli, P., Meli, A. The nonstop transvesical cystometrogram in urethane-anesthetized rats: a simple procedure for quantitative studies on the various phases of urinary bladder voiding cycle. J Pharmacol Methods. 15 (2), 157-167 (1986).
- Malmgren, A., et al. Cystometrical evaluation of bladder instability in rats with infravesical outflow obstruction. J Urol. 137 (6), 1291-1294 (1987).
- Pandita, R. K., Fujiwara, M., Alm, P., Andersson, K. E. Cystometric evaluation of bladder function in non-anesthetized mice with and without bladder outlet obstruction. J Urol. 164 (4), 1385-1389 (2000).
- Chang, H. Y., Havton, L. A. Differential effects of urethane and isoflurane on external urethral sphincter electromyography and cystometry in rats. Am J Physiol Renal Physiol. 295 (4), F1248-F1253 (2008).
- Matsuura, S., Downie, J. W. Effect of anesthetics on reflex micturition in the chronic cannula-implanted rat. Neurourol Urodyn. 19 (1), 87-99 (2000).
- DePaul, M. A., Lin, C. Y., Silver, J., Lee, Y. S. Peripheral Nerve Transplantation Combined with Acidic Fibroblast Growth Factor and Chondroitinase Induces Regeneration and Improves Urinary Function in Complete Spinal Cord Transected Adult Mice. PLoS One. 10 (10), e0139335 (2015).
- Kadekawa, K., et al. Characterization of bladder and external urethral activity in mice with or without spinal cord injury–a comparison study with rats. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 310 (8), R752-R758 (2016).
- Uvin, P., et al. The use of cystometry in small rodents: a study of bladder chemosensation. J Vis Exp. (66), (2012).
- Andersson, K. E., Soler, R., Fullhase, C. Rodent models for urodynamic investigation. Neurourol Urodyn. 30 (5), 636-646 (2011).
- Smith, P. P., Kuchel, G. A. Continuous uroflow cystometry in the urethane-anesthetized mouse. Neurourol Urodyn. 29 (7), 1344-1349 (2010).
- Aizawa, N., Homma, Y., Igawa, Y. Influence of High Fat Diet Feeding for 20 Weeks on Lower Urinary Tract Function in Mice. Low Urin Tract Symptoms. 5 (2), 101-108 (2013).
- Bjorling, D. E., et al. Evaluation of voiding assays in mice: impact of genetic strains and sex. Am J Physiol Renal Physiol. 308 (12), F1369-F1378 (2015).
- Morikawa, K., et al. Effects of various drugs on bladder function in conscious rats. Jpn J Pharmacol. 50 (4), 369-376 (1989).
- Yaksh, T. L., Durant, P. A., Brent, C. R. Micturition in rats: a chronic model for study of bladder function and effect of anesthetics. Am J Physiol. 251 (6 Pt 2), R1177-R1185 (1986).
- Cornelissen, L. L., Misajet, B., Brooks, D. P., Hicks, A. Influence of genetic background and gender on bladder function in the mouse. Auton Neurosci. 140 (1-2), 53-58 (2008).
- Lemack, G. E., Zimmern, P. E., Vazquez, D., Connell, J. D., Lin, V. K. Altered response to partial bladder outlet obstruction in mice lacking inducible nitric oxide synthase. J Urol. 163 (6), 1981-1987 (2000).
