Avaliando o procedimento para realizar cistometria acordada em um modelo de mouse
Summary
Este estudo descreve os procedimentos cirúrgicos e técnicas experimentais para realizar cistometria acordada em um mouse que se move livremente. Além disso, fornece evidências experimentais para apoiar sua otimização e padronização.
Abstract
A cistometria de enchimento acordada tem sido usada por um longo tempo para avaliar a função da bexiga em ratos que se movem livremente, no entanto, os métodos específicos utilizados variam entre os laboratórios. O objetivo deste estudo foi descrever o procedimento microcirúrgico utilizado para implantar um tubo intravesical e a técnica experimental para registro da pressão da bexiga urinária em um mouse acordado, movendo livremente. Além disso, dados experimentais são apresentados para mostrar como a cirurgia, bem como o tipo e tamanho da tubulação, afetam a função do trato urinário inferior ea sensibilidade de gravação. O efeito do diâmetro do tubo sobre o registo de pressão foi avaliado em tubos de polietileno e poliuretano com diferentes diâmetros internos. Subsequentemente, o tubo com melhor desempenho de ambos os materiais foi implantado cirurgicamente na cúpula da bexiga urinária de ratinhos C57BL / 6 machos. Foi registada uma frequência de micturização de doze horas durante a noite em animais e animais saudáveis e intactos 2, 3, 5 e 7 dias após a cirurgia. Na colheita, as bexigasForam avaliados para detectar sinais de inchaço usando a observação bruta e foram posteriormente processados para análise patológica. A maior extensão de inchaço da bexiga foi observada nos dias 2 e 3, o que correlacionou com dados de micção comportamental mostrando significativamente deteriorada função da bexiga. Ao dia 5, a histologia da bexiga e a frequência de micção tinham normalizado. Com base na literatura e na evidência fornecida por nossos estudos, propomos os seguintes passos para o registro in vivo da pressão intravesical e volume void em um mouse acordado: 1) Realizar a cirurgia usando um microscópio operacional e ferramentas microcirúrgicas, 2) Use polietileno-10 Tubulação para minimizar artefatos de movimento, e 3) Realizar cistometria no 5º dia pós-operatório, quando o inchaço da bexiga resolve.
Introduction
A cistometria de enchimento (FC) é um método de diagnóstico que envolve a colocação de um cateter na bexiga urinária para registrar a pressão durante o enchimento lento da bexiga. Introduzido pela primeira vez em 1927 como um método de diagnóstico clínico para avaliar a função do trato urinário inferior, manteve-se amplamente utilizado. 1 Em aplicações de pesquisa, o FC pode ser usado para testar a função da bexiga em modelos animais saudáveis e doentes e para estudar os efeitos de agentes farmacológicos. Modelos animais de roedores são comumente usados para investigar a função do trato urinário inferior. 2 Neste grupo de mamíferos, o FC foi inicialmente desenvolvido para uso em ratos. 3 Aqui, a metodologia para implantar um tubo na bexiga urinária e realizar FC foi bem descrita e utilizada por muitos pesquisadores com um nível aceitável de reprodutibilidade. 4 A disponibilidade de estirpes transgênicas e knock out torna os ratos uma espécie valiosa para inúmeras áreas de pesquisa,Incluindo o campo da disfunção do trato urinário inferior. A metodologia utilizada para realizar a cistometria do mouse varia sensivelmente entre laboratórios, dificultando a comparação dos resultados. 5
Comparado com os modelos ex vivo , o FC preserva a anatomia do tracto urinário inferior, permitindo avaliar a função coordenada entre a bexiga e a sua saída durante as fases de armazenamento e micção do ciclo miccional. Pesquisas anteriores mostram que numerosos, comumente utilizados anestésicos suprimir contração micção. Agentes que preservam a contração do músculo liso da bexiga urinária (uretano, α-cloralose, cetamina e xilazina), permitindo que o animal micure, ainda reduz significativamente a capacidade funcional da bexiga e suprime a neurotransmissão. 6 , 7 , 8 , 9 Embora tecnicamente mais desafiador, FC realizado em awPreservando a integridade funcional do reflexo miccional.
A função do trato urinário inferior é influenciada por múltiplos fatores, incluindo inchaço pós-operatório da parede da bexiga, estresse devido à dor e desconforto e influências ambientais. Utilizando uma técnica cirúrgica que minimiza o dano tecidual durante a implantação do tubo e os métodos de registro que reduzem o movimento do tubo, ao mesmo tempo em que permite que o animal ambule livremente, são essenciais para a obtenção de gravações precisas e reprodutíveis.
Se realizada adequadamente, in vivo FC em animais que se movem livremente pode fornecer dados que reflictam fielmente a função fisiológica da bexiga. 10 FC em animais em movimento livre pode fornecer dados sobre os seguintes parâmetros; Pressão basal ou basal: Pressão mínima entre duas micções. Pressão de intermitência: Pressão média entre duas micções. Pressão de limiar: Im pressão intravesicalAntes da micção. Pressão máxima: Pressão máxima da bexiga durante um ciclo de micção. Atividade espontânea (ou pressão média oscilatória de intermiturização): Pressão de intermetria menos pressão basal. Contrações não votivas: Aumento da pressão intravesical durante a fase de enchimento, não associado à liberação de fluido. Conformidade da bexiga: Capacidade da bexiga dividida pela pressão de limiar menos a pressão basal. Frequência de micção: Número de micções por unidade de tempo. Intervalo de intermitência: Período entre duas pressões de micção máximas. Capacidade da bexiga: volume infundido dividido pelo número de micções. Uma descrição detalhada destes parâmetros e terminologia padronizada foi publicada anteriormente. 11
FC pode ser realizada utilizando um método de infusão intravesical de ciclo único ou contínuo. A cistometria contínua permite o registro de múltiplos ciclos de micção e a seleção de dados representativosSobre a reprodutibilidade. Sua precisão na medição da capacidade da bexiga é limitada devido ao volume residual desconhecido. Além disso, é desafiador colecionar pequenos volumes anulados (os quais com base na tensão e no sexo variam entre 30 e 184 μL) em camundongos livremente ambulantes. A utilização deste método para registar volume esvaziado é menos precisa em comparação com uma preparação anestesiada, mas é superior na medida em que evita os efeitos supressores dos anestésicos na função da bexiga. A cistometria de ciclo único deve ser utilizada para avaliar a capacidade da bexiga. Neste método, a bexiga é esvaziada por aspiração antes da infusão e a capacidade é calculada como uma função da taxa de infusão multiplicada pelo tempo até à pressão máxima.
Embora a técnica de realização de cistometria em pequenos roedores tenha sido publicada, descreveu a cirurgia realizada em um rato e recomendou que a cistometria do mouse deve ser realizada sob anestesia com uretano. 10 O objetivo desta comunicação éO descrever tanto as técnicas microcirúrgicas utilizadas para implantar um tubo intravesical na cúpula da bexiga urinária quanto a configuração experimental usada para registrar a função do trato urinário inferior, in vivo , durante o enchimento contínuo da bexiga e a micção em um mouse livre acordado. Além disso, foram realizadas experiências para determinar como o comprimento, diâmetro e material da tubagem, bem como a metodologia para a realização de FC in vivo , afectam a gravação. Este protocolo experimental resume técnicas previamente publicadas e propõe uma série de modificações com base em resultados experimentais.
Protocol
Representative Results
Discussion
Óptimo material e tamanho da tubulação intravesical
Para determinar o efeito do diâmetro da tubulação em gravações de pressão, testámos diferentes tubos microfluídicos; PE50 (0,58 mm ID), poliuretano PU027 (0,4 mm ID), PE25 (0,46 mm ID) e PE10 (0,28 mm ID). Para cada tubo, a pressão foi registada com a bomba de infusão funcionando a 1 mL / h, enquanto se movia rapidamente o tubo verticalmente de 0 a 30 cm. As experiências iniciais in vivo tentaram usar a tubagem PE50, mas não tiv…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was funded by the Department of Surgery University of Vermont, Danish Council for Independent Research, and by the Odense University Hospital.
Materials
| Polyethylene (PE) 10 tubing | Instech | BTPE-10 | Fits 30G connectors/plugs |
| Polyethylene (PE) 50 tubing | Instech | BTPE-50 | Fits 22G connectors/plugs |
| 22ga single channel stainless steel swivel | Instech | 375/22 | |
| High Carbon Steel Utility Extension Spring (9/64" OD) | Grainger | 1NAH1 | Protects PE50 tubing – Cut to length |
| 22G connector | Instech | SP22/12 | |
| Yutaoz Professional Hot Melt Adhesive Glue Gun | Yutaoz | Use low temperature setting (100°C) – Any hot melt glue gun with an adjustable temperature range will work | |
| Surebonder DT-2010 all purpose glue stick | Surebonder | Any all purpose hot glue will work | |
| Dumont #5 curved microforceps | World Precision Instruments | 500232 | |
| Dumont #7 curved microforceps | World Precision Instruments | 14188 | |
| Mini dissecting scissors – straight | World Precision Instruments | 503240 | |
| Micro mosquito forceps (12.5cm) | World Precision Instruments | 500451 | |
| Dissecting scissors – straight | World Precision Instruments | 14393 | |
| Castroviejo Needle Holder | World Precision Instruments | 503258 | |
| Isoflurane, USP | Phoenix | 2%, 1 L/min flow rate | |
| Buprenorphine | 0.05mg/kg | ||
| 0.9% Sodium Chloride Irrigation, USP | Baxter | ||
| 6-0 Ethilon black monofilament, non-absorbable suture | Ethicon | Bladder tie | |
| 6-0 Vicryl violet braided, absorbable suture | Ethicon | Muscle suture, running | |
| 6-0 Prolene blue monofilament, non-absorbable suture | Ethicon | Skin suture, vertical mattress, buried interrupted | |
| KD Legato 210 infuse/withdraw pump | KD Scientific | 1.5ml/hr | |
| Disposable pressure transducer | Digitimer | NL108T2 | |
| Pressure Amplifier | Digitimer | NL108A | |
| Power1401-3 data acquisition interface | Digitimer | ||
| Spike2 | Cambridge Electronic Design Limited | PC pressure recording software | |
| Leica MZ6 surgical operating microscope (3.2-20X) | Leica Microsystems | Magnification |
References
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