Summary

Малые РНК Трансфекция в первичных человеческих Th17 клеток с помощью следующего поколения электропорации

Published: April 13, 2017
doi:

Summary

Next generation electroporation is an efficient method for transfecting human Th17 cells with small RNAs to alter gene expression and cell behavior.

Abstract

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated from naïve CD4+ T cells in vitro by activating them in the presence of the polarizing cytokines IL-1β, IL-6, IL-23, and TGFβ. Th17 cells orchestrate immunity against extracellular bacteria and fungi, but their aberrant activity has also been associated with several autoimmune and inflammatory diseases. Th17 cells are identified by the chemokine receptor CCR6 and defined by their master transcription factor, RORγt, and characteristic effector cytokine, IL-17A. Optimized culture conditions for Th17 cell differentiation facilitate mechanistic studies of human T cell biology in a controlled environment. They also provide a setting for studying the importance of specific genes and gene expression programs through RNA interference or the introduction of microRNA (miRNA) mimics or inhibitors. This protocol provides an easy to use, reproducible, and highly efficient method for transient transfection of differentiating primary human Th17 cells with small RNAs using a next generation electroporation device.

Introduction

CD4 + Т – клетки являются важными оркестраторами адаптивного иммунного ответа. Наивные CD4 + Т – клетки способны превращаться в нескольких различных эффекторных Т – клеток (например , Th1, Th2, Th17 и т.д.), каждый со своим собственным набором характерных цитокинов и факторов транскрипции, в зависимости от местного микроокружения 1. Решения линии преемственности, что Т-клетки составляют критичны как для защитного иммунитета и толерантности к себе. Th17 клетки представляют собой одно подмножество Т – клеток , известных для борьбы с внеклеточных бактерий и грибков, но их неправильные ответы также участвуют в патогенезе множества аутоиммунных и воспалительных заболеваний , таких как рассеянный склероз и псориаз 2, 3. Человеческие клетки Th17 могут быть получены из нативных CD4 + Т – клеток в пробирке путем предоставления им соответствующей поляризационной среды 4. Vario нас комбинации цитокинов IL-1β, IL-23, TGF-beta, и IL-6 были использованы для развития клеток Th17 человека. Человек Th17 клетки экспрессируют CCR6, рецептор хемокинов , который обычно используется , чтобы идентифицировать эту популяцию клеток и определяется выражением их основного фактора транскрипции, RORγt (кодируемого) RORC 5, 6. Th17 клетки обладают способностью выражать несколько цитокинов, но IL-17A является родословная определяющего эффектор цитокин, продуцируемый этими клетками. Мы исследовали экспрессию всех трех Th17-ассоциированных маркеров (CCR6, RORγt, IL-17A) для оценки надежности нашего человеческого Th17 в пробирке дифференциации анализа. Кроме того, мы культивировали человеческие CD4 + Т – клеток в неполяризующих условиях, в которых не добавл ли никакого цитокины или блокирующие антитела к культуральной среде , чтобы использовать в качестве отрицательного контроля , так как экспрессия этих маркеров Th17 должно быть очень низким или отсутствует.

ve_content "> Один из способов изучить нормальное развитие клеток человека T и биологии, чтобы манипулировать экспрессии генов в процессе их развития. Краткосрочные вмешательства РНК (миРНК) представляют собой синтетические небольшие молекулы РНК, которые нацелены на белок-кодирующих мРНК, и могут быть использованы для уменьшения специфической экспрессии гена . MicroRNAs (миРНК) является эндогенным некодирующим малым РНКОМ , известным для модуляции экспрессии гена посттранскрипционно. микроРНК , как было показан , играет важную роль как в мышином и биологии Т – клетки человека, в том числе в Th17 клетках 7, 8, 9. Это очень важно иметь надежные методы манипулирования небольшой РНК-активности в Т-клетках человека, чтобы изучить их влияние на экспрессию генов и в конечном счете на человеческой клеточной биологии T. Здесь мы опишем простой в использовании, последовательный и надежный протокол, который мы разработали для введения небольшой синтетический РНК и запертые нуклеиновые кислоты (МШИТ, химически модифицированные нуклеиновые кислоты с повышенной стабильностью)в клетки иммунной системы, а именно в Th17-клеток человека.

Есть несколько альтернативных способов введения малого РНКА в клетки млекопитающих, которые обычно попадают в химические, биологические или физические категории 10. Обычно используемые химические методы, в том числе на основе липидов и трансфекций кальция-фосфатной трансфекции, полагаются на создание комплексов химико-ДНК, которые более эффективно поглощаются клетками. В общем, химические методы не являются столь эффективными для трансфекции первичных Т-клеток. Наиболее распространенный биологический метод является использование вирусного вектора (например , ретровирус или лентивирус), который непосредственно вставляет внешний РНК в хозяин в качестве части своего естественного цикла репликации. Вирусные трансдукции, как правило, занимает больше времени, чтобы закончить, особенно когда факторы во время для молекулярного клонирования провирусных плазмид. Кроме того, вирусные векторы трансдукции могут быть потенциально опасными для человека исследователей. Электропорация является физическим менит индуцировать мембраны пермеабилизации, подвергая клетки воздействия высоких импульсов напряжения, позволяя нуклеиновые кислоты, чтобы транзиторно войти в камеру, где они могут действовать на своей цели. Традиционные электропорации инструменты не являются эффективными для трансфекции первичных лимфоцитов. Тем не менее, оптимизированная для следующего поколения электропорации, оказалось способной трансфекция Т-клеток при очень высокой эффективности, особенно когда материал для трансфекции мал РНК. Термин следующего поколения свободно используется , чтобы различать две новые платформы (например, неоновые, Amaxa) от традиционных электропорации машин. Кроме того, этот метод легко масштабируется для умеренных экранов пропускной способности с до приблизительно 120 малых РНК в одном эксперименте, часто с использованием проверенных синтетических реагентов. Важно отметить, что успешная трансфекция может быть достигнута в качестве всего лишь 16 ч после активации Т-клеток. Недостаток этого способа, однако, является то, что она не приводит к стабильной геномной incorporatiна, и поэтому преходяще. Следовательно, стоит дополнительных усилия, чтобы создать стабильную экспрессирующую конструкцию, которая может быть упакована в вирусный вектор и успешно высказанную в Т-клетках в тех случаях, когда требуется долгосрочное выражение малой РНК.

Мы использовали следующее поколение трансфекции (например, неон) для доставки различных синтетических одно- или двухцепочечных РНК или МШАТ олигонуклеотидных инструментов для различных целей 11, 12, 13. Эффективное РНК-интерференции может быть вызван в первичной мыши и Т-клеток человека с помощью двухцепочечной короткого вмешательства РНК (миРНК). Этот протокол описывает оптимизированные условия для использования этого метода в клетках Th17 человека. В дополнении к киРНКу, коммерчески доступный синтетический микроРНК подражает и ингибиторы могут быть использованы для изучения усиления микроРНКа и потери функции. микроРНК имитирует являются двухцепочечной молекулы РНК, очень похожие на киРНК, но Дизайнд с последовательностью эндогенного зрелого микроРНКа. ингибиторы микроРНК химически модифицированной РНК и / или LNA на основе одноцепочечных олигонуклеотидов, которые связываются с носителями микроРНК и противодействуют их функции. Мы обнаружили, что все эти инструменты могут быть эффективно использованы в культивируемых первичных Т-лимфоцитов, в том числе, но не ограничиваясь клеток Th17 человека.

Protocol

Этот протокол придерживается принципов UCSF для исследовательской этики человека. 1. Получение Т – клеточная культура, выделение CD4 + Т – клетки, и Th17 поляризации На день 0, пальто 6-луночных культуры тканей пластины с 1,5 мл на лунку анти-CD3 человека (2 мкг / мл) и а…

Representative Results

Первый шаг к разработке надежной системы успешно электропорации клеток Th17 человека было создание надежной в пробирке дифференцированы культур человека Th17 клеток. Т – клетки , культивированные в Th17-поляризационных условиях выразили хемокинов рецептор CCR6 и факто?…

Discussion

Этот протокол обеспечивает улучшенный способ доставки малых РНК в клетки Th17 человека. Хотя клетки Th17 человека здесь были использованы, этот метод электропорации с малым РНКОМ может быть использован с другими хелперами подмножествами первичного человеческим Т, такими как Th1, Th2, и Tregs. О?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the US National Institutes of Health grants (R01HL109102, P01HL107202, U19CA179512, F31HL131361), a Leukemia & Lymphoma Society scholar award (K.M.A.), and the National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) Medical Scientist Training Program (Grant #T32GM007618) (M.M.).

Materials

anti-human IL-17A PE ebioscience 12-7179-42  Clone: eBio64DEC17
anti-human IFNg FITC ebioscience 11-7319-82 Clone: 4S.B3
anti-human CD4 eVolve605 ebioscience 83-0047-42 Clone: SK3
mouse anti-human CD196 (CCR6) BV421 BD biosciences 562515 Clone: 11A9
anti-human RORgt AF647 BD biosciences 563620 Clone: Q21-559
anti-human CD45 eFluor450 ebioscience 48-9459-42 Clone: 2D1
Foxp3/Trascription Factor Staining Buffer Set ebioscience 00-5523-00 For intracellular transcription factor flow cytometry staining
Hu FcR Binding Inhibitor Purified ebioscience 14-9161-71
ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium Stemcell Technologies 10981 "Serum-Free Base Media"
MACS CD28 pure functional grade, human Miltenyi Biotec 130-093-375 Clone: 15E8
anti-human CD3 Purified UCSF monoclonal antibody core N/A Clone: OKT-3
LEAF purified anti-human IL-4 Biolegend 500815 Clone: MP4-25D2
anti-human IFNg, functional grade purified ebioscience 16-7318-85 Clone: NIB42
Recombinant human IL-23 Peprotech  200-23
Recombinant human IL-1β Peprotech  200-01B
Recombinant human TGF-β1 Peprotech  100-21C
Recombinant human IL-6 Peprotech  200-06
siGENOME Control Pool, Non-targeting #2 Dharmacon D-001206-14-05
siGENOME SMARTpool Human RORC Dharmacon M-003442-00
siGENOME SMARTpool Human PTPRC Dharmacon M-008067-01
Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit ThermoFisher Scientific 11346D Human CD4+ T cell Isolation Kit
Neon Tranfection System ThermoFisher Scientific MPK5000 Next generation electroporation instrument
Neon Tranfection System 10 μl Kit ThermoFisher Scientific MPK1096
Resuspension Buffer T ThermoFisher Scientific Provided in kit (MPK1096) "Transfection Resuspension Buffer"
Lymphoprep Stemcell Technologies #07801 Density Gradient Medium
costar 6-well tissue culture treated plates Corning 3516 flat bottom plates
costar 48-well tissue culture treated plates Corning 3548 flat bottom plates
BD Pharm Lyse lysing buffer, 10 X BD biosciences 555899 Must make 1X solution with distilled water prior to use

References

  1. Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of Effector CD4 T Cell Populations*. Ann Rev Immunol. 28 (1), 445-489 (2010).
  2. Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. IL-17 and Th17 Cells. Ann Rev Immunol. 27 (1), 485-517 (2009).
  3. Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J. The IL-23-IL-17 immune axis: from mechanisms to therapeutic testing. Nature. 14 (9), 585-600 (2014).
  4. Romagnani, S., Maggi, E., Liotta, F., Cosmi, L., Annunziato, F. Properties and origin of human Th17 cells. Mol Immunol. 47 (1), 3-7 (2009).
  5. Acosta-Rodriguez, E. V., et al. Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells. Nature Immunol. 8 (6), 639-646 (2007).
  6. Annunziato, F., et al. Phenotypic and functional features of human Th17 cells. J Exp Med. 204 (8), 1849-1861 (2007).
  7. Du, C., et al. MicroRNA miR-326 regulates TH-17 differentiation and is associated with the pathogenesis of multiple sclerosis. Nature Immunol. 10 (12), 1252-1259 (2009).
  8. Escobar, T. M., et al. miR-155 Activates Cytokine Gene Expression in Th17 Cells by Regulating the DNA-Binding Protein Jarid2 to Relieve Polycomb-Mediated Repression. Immunity. 40 (6), 865-879 (2014).
  9. Wang, H., et al. Negative regulation of Hif1a expression and TH17 differentiation by the hypoxia-regulated microRNA miR-210. Nature Immunol. 15 (4), 393-401 (2014).
  10. Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Anal bioanal chem. 397 (8), 3173-3178 (2010).
  11. Steiner, D. F., et al. MicroRNA-29 Regulates T-Box Transcription Factors and Interferon-γ Production in Helper T Cells. Immunity. 35 (2), 169-181 (2011).
  12. Simpson, L. J., et al. A microRNA upregulated in asthma airway T cells promotes TH2 cytokine production. Nature Immunol. 15 (12), 1162-1170 (2014).
  13. Pua, H. H., et al. MicroRNAs 24 and 27 Suppress Allergic Inflammation and Target a Network of Regulators of T Helper 2 Cell-Associated Cytokine Production. Immunity. 44 (4), 821-832 (2016).
  14. Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse Naïve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets. J Vis Exp. (98), (2015).
  15. Schumann, K., et al. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (33), 10437-10442 (2015).

Play Video

Cite This Article
Montoya, M. M., Ansel, K. M. Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation. J. Vis. Exp. (122), e55546, doi:10.3791/55546 (2017).

View Video