Summary

次世代エレクトロポレーションによって初代ヒトTh17細胞の小さなRNAのトランスフェクション

Published: April 13, 2017
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Summary

Next generation electroporation is an efficient method for transfecting human Th17 cells with small RNAs to alter gene expression and cell behavior.

Abstract

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated from naïve CD4+ T cells in vitro by activating them in the presence of the polarizing cytokines IL-1β, IL-6, IL-23, and TGFβ. Th17 cells orchestrate immunity against extracellular bacteria and fungi, but their aberrant activity has also been associated with several autoimmune and inflammatory diseases. Th17 cells are identified by the chemokine receptor CCR6 and defined by their master transcription factor, RORγt, and characteristic effector cytokine, IL-17A. Optimized culture conditions for Th17 cell differentiation facilitate mechanistic studies of human T cell biology in a controlled environment. They also provide a setting for studying the importance of specific genes and gene expression programs through RNA interference or the introduction of microRNA (miRNA) mimics or inhibitors. This protocol provides an easy to use, reproducible, and highly efficient method for transient transfection of differentiating primary human Th17 cells with small RNAs using a next generation electroporation device.

Introduction

CD4 + T細胞は、適応免疫応答の重要なオーケストレーターです。ナイーブCD4 + T細胞は、いくつかの異なるエフェクターT細胞( 例えば TH1、TH2、Th17細胞、 )に現像することが可能である、局所微小環境1に依存特性サイトカインおよび転写因子の独自のセットをそれぞれ。 T細胞が作る系譜の決定は、自己に対する防御免疫と寛容の両方のために重要です。 Th17細胞は、細胞外細菌および真菌に対抗することが知られているT細胞のサブセットであるが、その不適切な応答はまた、多発性硬化症および乾癬2、3のように複数の自己免疫疾患および炎症性疾患の病因に関与しています。ヒトTh17細胞は、適切な偏光環境4とそれらを提供することにより、in vitroでのナイーブCD4 + T細胞から生成することができます。バリオ私たちのサイトカインIL-1βの組み合わせ、IL-23、TGFβ、及びIL-6は、人間のTh17細胞の発達のために使用されています。ヒトTh17細胞はCCR6、一般的にこの細胞集団を同定するために使用され、それらの主要な転写因子、(RORCによってコードされる)のRORγt5、6の式で定義されるケモカイン受容体を発現します。 Th17細胞は、複数のサイトカインを発現する能力を有するが、IL-17Aは、これらの細胞によって産生さ系統規定エフェクターサイトカインです。私たちは、ヒトTh17細胞のin vitro分化アッセイの頑健性を評価するために、3つのすべてのTh17関連マーカー(CCR6、のRORγt、IL-17A)の発現を調べました。また、我々は、これらのTh17マーカーの発現が非常に低いかまたは存在しないなければならないので、何のサイトカインまたはブロッキング抗体を陰性対照として使用するために培地に添加しなかった非分極条件下でヒトCD4 + T細胞を培養しました。

ve_content ">正常ヒトT細胞の発達及び生物学を研究する1つの方法は、開発中の遺伝子発現を操作することである。短干渉RNA(siRNA)は、タンパク質をコードするmRNAを標的とする合成小RNA分子であり、特定の遺伝子の発現を減少させるために利用することができます。マイクロRNA(miRNA)は転写後遺伝子発現を調節することが知られている内因性の非コード小型RNAである。miRNAは、Th17細胞7、8、9に含め、マウスおよびヒトT細胞生物学の両方で重要な役割を果たしていることが示されている。これは、遺伝子発現に及ぼす影響を研究するために、ヒトT細胞の小さなRNAの活動を操作し、最終的にはヒトT細胞生物学上の信頼性の高い方法を持つことが重要です。ここでは、我々は我々が導入するために開発さ簡単に使用できる、一貫性と信頼性プロトコルを記述小さな合成RNAおよびロックされた核酸(LNA、増大した安定性を有する化学的に修飾された核酸)免疫細胞への、そして、ヒトTh17細胞へ。

一般に、化学、生物学的、または物理的なカテゴリ10に分類された哺乳動物細胞、内低分子RNAを導入するいくつかの代替方法があります。脂質ベースのトランスフェクション、およびリン酸カルシウムのトランスフェクションを含む一般的に使用される化学的方法は、より効率的に細胞に取り込まれている化学-DNA複合体を作成することに依存しています。一般的に、化学的方法は、一次T細胞のトランスフェクション用として効率的ではありません。最も一般的な生物学的方法は、直接的にその天然の複製サイクルの一部として宿主に外来RNAを挿入するウイルスベクター( 例えばレトロウイルスまたはレンチウイルス)を使用することです。ウイルス形質導入は、一般的にプロウイルスプラスミドの分子クローニングのための時間にする場合は特に1つの要因、完了するまでに時間がかかります。また、ウイルス形質導入ベクターとしては、人間の研究者に対して潜在的に有害であり得ます。エレクトロポレーションは、物理mで核酸は一過性に、彼らは彼らのターゲットに作用することができセルに入力することができ、高電圧パルスに細胞を付すことにより、膜透過性を誘導するethod。従来のエレクトロポレーション機器は、初代リンパ球をトランスフェクトするための効果的ではなかったです。しかし、最適化された次世代のエレクトロポレーションは、トランスフェクトされる材料は、小さいRNAである場合は特に、非常に高い効率でT細胞をトランスフェクトすることができることが証明されています。用語次の世代は緩く、伝統的なエレクトロポレーションマシンから2つの新しいプラットフォーム( 例えば 、ネオン、AMAXA)を区別するために使用されます。また、この方法は、多くの場合、検証合成試薬を用いて単一の実験で最大約120小RNAと中程度のスループットスクリーニングのために容易に拡張可能です。重要なことに、成功したトランスフェクションは、T細胞活性化後にわずか16のような時間で達成することができます。この方法の欠点は、しかし、それは安定したゲノムincorporatiが生じないということです上、したがって、一過性です。したがって、ウイルスベクターにパッケージングされ、正常に小さなRNAの長期発現が必要とされる場合にはT細胞で発現させることができる安定した発現構築物を作成するために余分な労力の価値があります。

我々は、異なる目的の11、12、13のために多様な合成一本鎖または二本鎖RNA又はLNAオリゴヌクレオチドのツールを提供する次世代のトランスフェクション( 例えば 、ネオン)を使用しています。効率的なRNA干渉は、二本鎖短干渉RNA(siRNA)を使用して、一次マウスおよびヒトT細胞において誘導することができます。このプロトコルは、ヒトTh17細胞は、この技術を使用するための最適化された条件を記載しています。 siRNAに加えて、市販の合成miRNA模倣剤および阻害剤は、機能のmiRNAの利得及び損失を研究するために使用することができます。 miRNA模倣は、siRNAと非常に類似した二本鎖RNA分子であるが、デザイン性は、内因性の成熟miRNAの配列とD。 miRNA阻害剤は、化学的に修飾されたRNAおよび/または天然のmiRNAに結合し、その機能を拮抗するLNAベースの一本鎖オリゴヌクレオチドです。私たちは、これらのツールのすべてを含めて、初代培養Tリンパ球に効果的に使用されるが、人間のTh17細胞に限定されないことができることを見出しました。

Protocol

このプロトコルは、人間研究倫理のためのUCSFのガイドラインに準拠しています。 T細胞培養、CD4 + T細胞の単離、及びのTh17分極の調製 少なくとも2時間、カルシウムおよびマグネシウムを含むPBS中の抗ヒトCD3(2μg/ ml)および抗ヒトCD28(4μgの/ mL)をウェル当たり1.5mLの0日目に、コート6ウェル組織培養プレート37°C。 代替的に、4℃で一?…

Representative Results

正常ヒトTh17細胞をエレクトロポレーションの信頼性の高いシステムを開発するための最初のステップは、 インビトロ分化ヒトのTh17細胞培養におけるロバスト生成することでした。 Th17分極条件下で培養T細胞は、ケモカイン受容体CCR6および転写因子のRORγt( 図1A、左)を発現しました。 T細胞は(右図1A)非偏光(THN)条件下で?…

Discussion

このプロトコルは、ヒトTh17細胞への小RNAの送達のための改良された方法を提供します。ヒトTh17細胞は、ここで使用されたが、低分子RNAとエレクトロポレーションのこの方法は、TH1、TH2及びTregのような他の初代ヒトTヘルパーサブセットと共に使用することができます。細胞はトランスフェクションの前に培養して活性化されなければならないので、ナイーブCD4 + T細胞についてうまく…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the US National Institutes of Health grants (R01HL109102, P01HL107202, U19CA179512, F31HL131361), a Leukemia & Lymphoma Society scholar award (K.M.A.), and the National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) Medical Scientist Training Program (Grant #T32GM007618) (M.M.).

Materials

anti-human IL-17A PE ebioscience 12-7179-42  Clone: eBio64DEC17
anti-human IFNg FITC ebioscience 11-7319-82 Clone: 4S.B3
anti-human CD4 eVolve605 ebioscience 83-0047-42 Clone: SK3
mouse anti-human CD196 (CCR6) BV421 BD biosciences 562515 Clone: 11A9
anti-human RORgt AF647 BD biosciences 563620 Clone: Q21-559
anti-human CD45 eFluor450 ebioscience 48-9459-42 Clone: 2D1
Foxp3/Trascription Factor Staining Buffer Set ebioscience 00-5523-00 For intracellular transcription factor flow cytometry staining
Hu FcR Binding Inhibitor Purified ebioscience 14-9161-71
ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium Stemcell Technologies 10981 "Serum-Free Base Media"
MACS CD28 pure functional grade, human Miltenyi Biotec 130-093-375 Clone: 15E8
anti-human CD3 Purified UCSF monoclonal antibody core N/A Clone: OKT-3
LEAF purified anti-human IL-4 Biolegend 500815 Clone: MP4-25D2
anti-human IFNg, functional grade purified ebioscience 16-7318-85 Clone: NIB42
Recombinant human IL-23 Peprotech  200-23
Recombinant human IL-1β Peprotech  200-01B
Recombinant human TGF-β1 Peprotech  100-21C
Recombinant human IL-6 Peprotech  200-06
siGENOME Control Pool, Non-targeting #2 Dharmacon D-001206-14-05
siGENOME SMARTpool Human RORC Dharmacon M-003442-00
siGENOME SMARTpool Human PTPRC Dharmacon M-008067-01
Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit ThermoFisher Scientific 11346D Human CD4+ T cell Isolation Kit
Neon Tranfection System ThermoFisher Scientific MPK5000 Next generation electroporation instrument
Neon Tranfection System 10 μl Kit ThermoFisher Scientific MPK1096
Resuspension Buffer T ThermoFisher Scientific Provided in kit (MPK1096) "Transfection Resuspension Buffer"
Lymphoprep Stemcell Technologies #07801 Density Gradient Medium
costar 6-well tissue culture treated plates Corning 3516 flat bottom plates
costar 48-well tissue culture treated plates Corning 3548 flat bottom plates
BD Pharm Lyse lysing buffer, 10 X BD biosciences 555899 Must make 1X solution with distilled water prior to use

References

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Cite This Article
Montoya, M. M., Ansel, K. M. Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation. J. Vis. Exp. (122), e55546, doi:10.3791/55546 (2017).

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