Summary

Grabaciones con abrazadera de parche de células enteras para la determinación electrofisiológica de la selectividad iónica en canalrhodopsins

Published: May 22, 2017
doi:

Summary

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.

Abstract

Durante la última década, los channelrhodopsins se hicieron indispensables en la investigación neurocientífica donde se utilizan como herramientas para manipular de manera no invasiva procesos eléctricos en células diana. En este contexto, la selectividad iónica de una canalrhodopsina es de particular importancia. En este artículo se describe la investigación de la selectividad del cloruro para una canalrhodopsina de Proteomonas sulcata conductora de aniones recientemente identificada mediante grabaciones electrofisiológicas de la placa de sujeción en células HEK293. El procedimiento experimental para la medición de fotocorrientes de luz-gated requiere una fuente de luz conmutable rápida – idealmente monocromática – acoplada en el microscopio de una instalación de parche-abrazadera de otro modo convencional. Se describen los procedimientos preparativos previos al experimento que incluyen la preparación de soluciones tamponadas, consideraciones sobre los potenciales de unión de lıquidos, siembra y transfección de células y extracción de las pipetas de parche. La grabación real de la relación tensión-corrienteS para determinar los potenciales de inversión para diferentes concentraciones de cloruro se produce 24 h a 48 h después de la transfección. Por último, los datos electrofisiológicos se analizan con respecto a las consideraciones teóricas de la conducción de cloruro.

Introduction

Channelrhodopsins (ChR) son canales de iones ligeros que se producen en el ojo de las algas verdes móviles, y sirven como fotosensores primarios para fototaxis y respuestas fóbicas [ 1] . Desde su primera descripción en 2002 [ 2] , ChRs han allanado el camino para el campo emergente de la optogenética y se puede aplicar en una variedad de células excitables, por ejemplo, dentro de los músculos esqueléticos, el corazón o el cerebro [ 3 , 4 , 5] . La expresión de ChRs en células diana da como resultado la permeabilidad iónica controlable por luz de la célula respectiva. En un contexto neuronal, esto permite la activación 6 , 7 , 8 o inhibición 9 , 10 del potencial de acción (AP) disparando – dependiendo del ión conducido – con el espacio y temporalPrecisión de la luz enfatizando cómo la selectividad iónica de una variante ChR determina su aplicación optogenética.

Los primeros ChRs descubiertos de Chlamydomonas reinhardtii y Volvox carteri son permeables a los protones, pero también a los cationes monovalentes como el sodio, el potasio y, en menor medida, a los cationes divalentes como el calcio y el magnesio 11 , 12 , 13 . Hoy en día, más de 70 canalrhodopsins (CCRs) 14 , 15 , 16 , 17 de conducción de cationes naturales y varias variantes 18 , 19 , 20 de ingeniería con diferentes propiedades tales como El tamaño de la fotocorriente, la sensibilidad espectral, la cinética y la selectividad del catión. Mientras que en neurociencia, CCRs aRe utilizados para activar las células y disparar APs, bombas microbianas impulsadas por la luz fueron los únicos antagonistas disponibles para silenciar las neuronas durante años. En 2014, dos grupos mostraron simultáneamente que CCRs pueden ser convertidos en anión-conductora channelrhodopsins (ACRs) por la alteración de la polaridad a lo largo de la putativo ión de conducción poros a través de ingeniería molecular 9 , 21 . Posteriormente, ACRs naturales se identificaron en varios criptofitos alga 22 , 23 , 24 . Más importante aún, la activación de luz de ACRs media las corrientes de cloruro en las neuronas adultas permitiendo la inhibición de la actividad neuronal a intensidades de luz mucho más bajas que las bombas microbianas que sólo transportan cargas únicas por fotón absorbido.

La actividad de ChR se puede abordar directamente mediante grabaciones electrofisiológicas de las corrientes inducidas por luz en las células HEK293. La abrazadera de parcheTécnica fue desarrollada originalmente a finales de los años setenta 25 y mejorada por Hamill et al. , Permitiendo el registro de la entidad de corrientes desde una célula pequeña (modo de célula completa) con alta resolución de corriente y control directo de la tensión de membrana 26 . Aplicada en cultivo celular, esta técnica proporciona un control preciso de las condiciones de grabación iónica y eléctrica y permite estudiar la selectividad de iones junto con la contribución relativa de los iones a la corriente total. Aquí se ejemplifica el examen de la selectividad iónica de la canalrhodopsina conductora de aniones de Proteomonas sulcata ( Ps ACR1) 22 , 23 mediante el registro de las relaciones tensión-corriente en varias concentraciones de cloruro extracelular para demostrar una alta conductancia del cloruro.

Protocol

Figura 1: Configuración de la abrazadera de parche. (1) fuente de luz, (2) fibra óptica, (3) obturador programable, (4) digitalizador, (5) controlador de obturador, (6) amplificador, (7) sistema de perfusión, (8) ordenador personal, , (11) etapa de microscopio, (12) entrada de perfusión, (13) salida de perfusión, (14) cámara de registro, (15) sensor de nivel de fluido, (16) electrodo de baño c…

Representative Results

La Figura 2 muestra los resultados representativos obtenidos de las mediciones siguiendo el protocolo descrito. Durante la iluminación con luz verde, Ps ACR1 presenta una corriente transitoria rápida que desciende rápidamente a un nivel de corriente estacionario. Después de que se apaga la luz, las fotocorrientes decaen a cero en milisegundos ( Figura 2A ). El intercambio de la concentración de cloruro extracelular provoca un desplaza…

Discussion

La determinación de los potenciales de inversión en condiciones iónicas y eléctricas definidas proporciona información sobre las especies de iones transportadas después de la activación de luz de ChRs. Si exclusivamente varía una especie iónica en un medio fisiológico complejo y el potencial de inversión invertido se desplaza según el potencial teórico de Nernst, esta especie iónica es la única transportada.

Sin embargo, para ChRs, los cambios potenciales de reversión suelen …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Maila Reh, Tharsana Tharmalingam y especialmente Altina Klein por su excelente asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Alemana de Investigación (DFG) (SFB1078 B2, FOR1279 SPP1665 a PH) y el Cluster of Excellence Unifying Concepts en Catálisis, UniCat, BIG-NSE (JV) y E4 (PH).

Materials

HEK293 cells Sigma Aldrich 85120602 Human embryonic kidney cells
Retinal Sigma Aldrich R2500 all-trans retinal
FuGENE HD Promega E2312 Transfection reagent
DMEM Biochrome FG 0445 Dulbecco's Modified Eagle Medium
Agarose Roth 3810 Agar bridges
CaCl2 Roth 5239 CaCl2 2H2O
CsCl Biomol 2452
EGTA Roth 3054
FBS Biochrome S0615 Cell culture
Glucose Roth HN06 D(+)-Glucose
KCl Roth 6781
MgCl2 Roth 2189 MgCl2 6H2O
NaCl Roth 3957
NMG Sigma Aldrich M2004 N-Methyl-D-glucamine
Na-Aspartate Sigma Aldrich A6683 L-Aspartic acid sodium salt monohydrate
Citric acid Roth 6490
AgeI ThermoFischerScientific ER1462 Restriction enzyme
XhoI ThermoFischerScientific ER0695 Restriction enzyme
NheI ThermoFischerScientific ER0975 Restriction enzyme
XL1Blue E.coli/ Agilent Technologies 200249 Chemocompetent E.coli
Kanamycin Roth T832
Lysogeny broth medium Roth X964
Agar-Agar Roth 6494 Agar plates
Plasmid purification kit Marchery-Nagel 740727.25
Penicilin/Streptomycin Biochrome A 2213 Cell culture
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma Aldrich P6407-5MG Cover slip coating
Microforge Custom made Fire polishing
Serological pipettes TPP Different sizes
Clean bench Kojair Biowizard SL130
Stirrer IKA RCT classic
Silver wire Science Products AG-T25; AG-T10 Electrodes, 0.64 mm (bath); 0.25 mm (electrode)
pH-meter Knick 765 Calimetric
Osmometer Vogel OM 815
Microscope Carl Zeiss ID03 Fire polishing
CO2 incubator Binder CB150
Cell culture dishes TPP 93040 34 mm internal diameter
Cover slips Roth P232 15 mm diameter
Thermometer Rössel Messtechnik MTM12
Beamsplitter Chroma 21011 90/10 transmission
Pipette holder ALA Scientific Instruments PPH-1P-AXU-0-1.5
Headstage Molecular Devices CV203BU
Amplifier Molecular Devices AxoPatch200B
Digitizer Molecular Devices DigiData1400 Digital analog converter
Lightsource TILL Photonics Polychrome V Set to 540 nm full intensity
Microscope Carl Zeiss Axiovert 100
Shutter Vincent Associates VS25
Shutter driver Vincent Associates VCM-D1
Glass capilarries Warner Instruments G150F-3 Boresilicate capillaries with fire polished ends OD 1.5 mm ID  0.86 mm
Micropipette puller Sutter Instruments P1000
Bath handler Lorenz Messgerätebau MPCU
Tripleband filterset Chroma 69008 Fluorescence filter  ECFP/EYFP/mCherry 
CCD camera Watec Wat-221SCCD
Optometer Gigahertz Optik P9710 Measure light intensities
Objective Carl Zeiss 421462-9900-000 W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC
Micromanipulator Scientifica PatchStar
Recording chamber Custom made
Power supply Manson HCS-3202 Avoids electrical noise from microscope built-in power supply
Vibration isolated table Newport M-VW-3636-OPT-01
Faraday cage Custom made or any commercial matching table
Hoses Any comercial; e.g. Roth Different sizes and materials for bath handling and application of pipette pressure; agar bridges
Linear shaker Sunlab Instruments SU 1000
Liquid junction potential calculator Molecular Devices or directly from Peter H. Barry Program is included in the Clampex aquisition software or can be obtained from  p.barry@unsw.edu.au
Data acquisition software Molecular Devices Clampex 10.X
Data evaluation software Molecular Devices Clampfit 10.X
PsACR1 GenBank or Addgene KF992074.1 or Addgene plasmid #85465 Gene encoding for PsACR1
Amplifier guide Molecular Devices The Axon Guide

References

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Grimm, C., Vierock, J., Hegemann, P., Wietek, J. Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins. J. Vis. Exp. (123), e55497, doi:10.3791/55497 (2017).

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