Summary

كامل خلية التصحيح المشبك تسجيلات لتحديد الكهربية من أيون الانتقائية في تشانلرودوبسينز

Published: May 22, 2017
doi:

Summary

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.

Abstract

على مدى العقد الماضي، أصبح تشانلرودوبسينز لا غنى عنه في البحوث علم الأعصاب حيث أنها تستخدم كأدوات للتلاعب غير الغازية العمليات الكهربائية في الخلايا المستهدفة. في هذا السياق، الانتقائية أيون من تشانلرودوبسين هي ذات أهمية خاصة. توضح هذه المقالة التحقيق في انتقائية الكلوريد ل أنيون-كونفيغنينغ تشانلرودوبسين من بروتيموناس سولكاتا عن طريق التسجيلات الكهربية التصحيح المشبك على خلايا HEK293. الإجراء التجريبي لقياس فوتوكرنتس بوابات الخفيفة يتطلب سريع للتحويل – أحادية اللون مثالي – مصدر الضوء إلى جانب المجهر من الإعداد على خلاف ذلك التصحيح المشبك التقليدي. يتم توضيح الإجراءات التحضيرية قبل التجربة التي تنطوي على إعداد حلول مخزنة، والاعتبارات على إمكانيات تقاطع السائل، والبذر وترنسفكأيشن من الخلايا، وسحب ماصات التصحيح. التسجيل الفعلي للعلاقة الجهد الحاليثانية لتحديد إمكانات انعكاس لمختلف تركيزات الكلوريد يأخذ مكان 24 ساعة إلى 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن. وأخيرا، يتم تحليل البيانات الكهربية فيما يتعلق الاعتبارات النظرية من توصيل الكلوريد.

Introduction

تشانلرودوبسينز (شر) هي قنوات ايون ضوء بوابات التي تحدث في بقعة العين من الطحالب الخضراء المتحركة، وتكون بمثابة أجهزة الاستشعار الضوئية الأولية للالاستشعار والردود الرهابية 1 . منذ وصفها الأول في عام 2002 2 ، شرس مهدت الطريق لمجال الناشئة من علم الوراثة الضوئية ويمكن تطبيقها في مجموعة متنوعة من الخلايا المنفعلة على سبيل المثال داخل العضلات والهيكل العظمي، والقلب، أو الدماغ 3 ، 4 ، 5 . التعبير عن شرس في الخلايا المستهدفة النتائج في نفاذية أيون الضوء يمكن السيطرة عليها من الخلية المعنية. في سياق الخلايا العصبية، وهذا يسمح تفعيل 6 ، 7 ، 8 أو تثبيط 9 ، 10 من العمل المحتملة (أب) إطلاق – اعتمادا على أيون أجريت – مع المكانية والزمانيةدقة الضوء التي تؤكد كيفية انتقائية أيون من البديل شر يحدد تطبيق أوبتوجينيتيك لها.

وقد اكتشفت أول شرس من كلاميدوموناس راينهاردتي وفولفوكس كارتيري نفاذية للبروتونات، ولكن أيضا إلى الكاتيونات أحادي التكافؤ مثل الصوديوم والبوتاسيوم، وبدرجة أقل إلى الكاتيونات ثنائي التكافؤ مثل الكالسيوم والمغنيسيوم 11 ، 12 ، 13 . اليوم، أكثر من 70 الموجبة الطبيعية الموجبة تشانلرودودبسينز (سرس) 14 و 15 و 16 و 17 والعديد من المتغيرات المهندسة 18 و 19 و 20 مع خصائص مختلفة مثل حجم فوتوكرنت، حساسية الطيفية، حركية، الانتقائية الموجبة المتاحة. بينما في علم الأعصاب، سرس أإعادة استخدامها لتنشيط الخلايا وإطلاق أبس، كانت المضخات الميكروبية مدفوعة ضوء المضادات المتاحة فقط لإسكات الخلايا العصبية لسنوات. في عام 2014، أظهرت مجموعتان في وقت واحد أن سرس يمكن تحويلها إلى أنيون-ترانزلاتيوندودوبسينز (أكرس) عن طريق تغيير القطبية على طول المسود أيون إجراء المسام عن طريق الهندسة الجزيئية 9 ، 21 . وفي وقت لاحق، تم تحديد أكر الطبيعية في العديد من الطحالب كريبتوفيت 22 ، 23 ، 24 . الأهم من ذلك، تفعيل ضوء أكرس يتوسط تيارات الكلوريد في الخلايا العصبية البالغة السماح تثبيط نشاط الخلايا العصبية في شدة الضوء أقل بكثير من المضخات الميكروبية التي تنقل فقط رسوم واحدة لكل الفوتون استيعابها.

نشاط كر يمكن معالجتها مباشرة عن طريق التسجيلات الكهربية التصحيح المشبك من التيارات التي يسببها الضوء في خلايا HEK293. التصحيح المشبكوقد تم تطوير تقنية أصلا في أواخر 1970s 25 ومواصلة تحسينها من قبل هاميل وآخرون. ، مما يسمح لتسجيل كيان التيارات من خلية صغيرة (وضع خلية كاملة) مع ارتفاع القرار الحالي والتحكم المباشر من الجهد الغشاء 26 . تطبق هذه التقنية في ثقافة الخلية، وتوفر التحكم الدقيق في ظروف التسجيل الأيونية وكذلك الكهربائية، وتمكن من دراسة الانتقائية الأيونية جنبا إلى جنب مع المساهمة النسبية للأيونات إلى التيار الكلي. هنا نحن تجسد فحص أيون الانتقائية ل أنيون-ترانزلاتيونرودوبسين من بروتيوموناس سولكاتا ( بس ACR1) 22 ، 23 عن طريق تسجيل العلاقات الجهد الحالي تحت مختلف تركيزات كلوريد خارج الخلية لإثبات ارتفاع كلوريد تصرف.

Protocol

الشكل 1: الإعداد التصحيح المشبك. (1) مصدر الضوء، (2) الألياف البصرية، (3) برمجة مصراع، (4) محول الأرقام، (5) سائق مصراع، (6) مكبر للصوت، (7) نظام نضح، (10) قفص فاراداي و (11) مرحلة مجهر و (12) مدخل نضح و (13) مخرج نضح و (14) …

Representative Results

ويبين الشكل 2 النتائج التمثيلية التي تم الحصول عليها من القياسات التالية بروتوكول وصفها. خلال الإضاءة مع الضوء الأخضر، بس ACR1 يتميز تيار عابر سريع الذي يتحلل بسرعة إلى مستوى ثابت الحالي. بعد أن يتم إيقاف الضوء، فوتوكرنتس تسوس إلى ال?…

Discussion

تحديد إمكانات عكس في ظروف الأيونية والكهربائية محددة يوفر معلومات عن الأنواع الأيونية المنقولة بعد تفعيل الضوء من شر. إذا تنوعت الأنواع الأيونية حصريا في وسط فسيولوجي معقد، وتحولت إمكانية الانعكاس التي تم الحصول عليها وفقا لإمكانية نيرنست النظرية، فإن هذا النوع من…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر مايلا ريه، ثارسانا ثارمالينجام وخاصة ألتينا كلاين للمساعدة التقنية الممتازة. وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة البحوث الألمانية (SFB1078 B2، FOR1279 SPP1665 إلى ف) ومجموعة المفاهيم الموحدة التميز في الحفز، ونيكات، بيج-نس (جف) و E4 (ف).

Materials

HEK293 cells Sigma Aldrich 85120602 Human embryonic kidney cells
Retinal Sigma Aldrich R2500 all-trans retinal
FuGENE HD Promega E2312 Transfection reagent
DMEM Biochrome FG 0445 Dulbecco's Modified Eagle Medium
Agarose Roth 3810 Agar bridges
CaCl2 Roth 5239 CaCl2 2H2O
CsCl Biomol 2452
EGTA Roth 3054
FBS Biochrome S0615 Cell culture
Glucose Roth HN06 D(+)-Glucose
KCl Roth 6781
MgCl2 Roth 2189 MgCl2 6H2O
NaCl Roth 3957
NMG Sigma Aldrich M2004 N-Methyl-D-glucamine
Na-Aspartate Sigma Aldrich A6683 L-Aspartic acid sodium salt monohydrate
Citric acid Roth 6490
AgeI ThermoFischerScientific ER1462 Restriction enzyme
XhoI ThermoFischerScientific ER0695 Restriction enzyme
NheI ThermoFischerScientific ER0975 Restriction enzyme
XL1Blue E.coli/ Agilent Technologies 200249 Chemocompetent E.coli
Kanamycin Roth T832
Lysogeny broth medium Roth X964
Agar-Agar Roth 6494 Agar plates
Plasmid purification kit Marchery-Nagel 740727.25
Penicilin/Streptomycin Biochrome A 2213 Cell culture
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma Aldrich P6407-5MG Cover slip coating
Microforge Custom made Fire polishing
Serological pipettes TPP Different sizes
Clean bench Kojair Biowizard SL130
Stirrer IKA RCT classic
Silver wire Science Products AG-T25; AG-T10 Electrodes, 0.64 mm (bath); 0.25 mm (electrode)
pH-meter Knick 765 Calimetric
Osmometer Vogel OM 815
Microscope Carl Zeiss ID03 Fire polishing
CO2 incubator Binder CB150
Cell culture dishes TPP 93040 34 mm internal diameter
Cover slips Roth P232 15 mm diameter
Thermometer Rössel Messtechnik MTM12
Beamsplitter Chroma 21011 90/10 transmission
Pipette holder ALA Scientific Instruments PPH-1P-AXU-0-1.5
Headstage Molecular Devices CV203BU
Amplifier Molecular Devices AxoPatch200B
Digitizer Molecular Devices DigiData1400 Digital analog converter
Lightsource TILL Photonics Polychrome V Set to 540 nm full intensity
Microscope Carl Zeiss Axiovert 100
Shutter Vincent Associates VS25
Shutter driver Vincent Associates VCM-D1
Glass capilarries Warner Instruments G150F-3 Boresilicate capillaries with fire polished ends OD 1.5 mm ID  0.86 mm
Micropipette puller Sutter Instruments P1000
Bath handler Lorenz Messgerätebau MPCU
Tripleband filterset Chroma 69008 Fluorescence filter  ECFP/EYFP/mCherry 
CCD camera Watec Wat-221SCCD
Optometer Gigahertz Optik P9710 Measure light intensities
Objective Carl Zeiss 421462-9900-000 W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC
Micromanipulator Scientifica PatchStar
Recording chamber Custom made
Power supply Manson HCS-3202 Avoids electrical noise from microscope built-in power supply
Vibration isolated table Newport M-VW-3636-OPT-01
Faraday cage Custom made or any commercial matching table
Hoses Any comercial; e.g. Roth Different sizes and materials for bath handling and application of pipette pressure; agar bridges
Linear shaker Sunlab Instruments SU 1000
Liquid junction potential calculator Molecular Devices or directly from Peter H. Barry Program is included in the Clampex aquisition software or can be obtained from  p.barry@unsw.edu.au
Data acquisition software Molecular Devices Clampex 10.X
Data evaluation software Molecular Devices Clampfit 10.X
PsACR1 GenBank or Addgene KF992074.1 or Addgene plasmid #85465 Gene encoding for PsACR1
Amplifier guide Molecular Devices The Axon Guide

References

  1. Hegemann, P. Algal sensory photoreceptors. Annu. Rev. Plant Biol. 59, 167-189 (2008).
  2. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae. Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).
  3. Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of contractile function in skeletal muscle. Nat. Commun. 6 (7153), 1-8 (2015).
  4. Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo. Nat. Methods. 7 (11), 897-900 (2010).
  5. Zhang, F., et al. The microbial opsin family of optogenetic tools. Cell. 147 (7), 1446-1457 (2011).
  6. Nagel, G., et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr. Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
  7. Li, X., et al. Fast noninvasive activation and inhibition of neural and network activity by vertebrate rhodopsin and green algae channelrhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (49), 17816-17821 (2005).
  8. Ishizuka, T., Kakuda, M., Araki, R., Yawo, H. Kinetic evaluation of photosensitivity in genetically engineered neurons expressing green algae light-gated channels. Neurosci. Res. 54 (2), 85-94 (2006).
  9. Wietek, J., et al. Conversion of channelrhodopsin into a light-gated chloride channel. Science. 344 (6182), 409-412 (2014).
  10. Berndt, A., et al. Structural foundations of optogenetics: Determinants of channelrhodopsin ion selectivity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 113 (4), 822-829 (2016).
  11. Tsunoda, S. P., Hegemann, P. Glu 87 of Channelrhodopsin-1 Causes pH-dependent Color Tuning and Fast Photocurrent Inactivation. Photochem. Photobiol. 85 (2), 564-569 (2009).
  12. Schneider, F., Gradmann, D., Hegemann, P. Ion selectivity and competition in channelrhodopsins. Biophys. J. 105 (1), 91-100 (2013).
  13. Govorunova, E. G., Spudich, E. N., Lane, C. E., Sineshchekov, O. A., Spudich, J. L. New Channelrhodopsin with a Red-Shifted Spectrum and Rapid Kinetics from Mesostigma viride. MBio. 2 (3), 1-9 (2011).
  14. Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Li, H., Janz, R., Spudich, J. L. Characterization of a highly efficient blue-shifted channelrhodopsin from the marine alga Platymonas subcordiformis. J. Biol. Chem. 288 (41), 29911-29922 (2013).
  15. Hou, S. -. Y., et al. Diversity of Chlamydomonas Channelrhodopsins. Photochem. Photobiol. 88 (1), 119-128 (2012).
  16. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat. Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
  17. Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophys. J. 96 (5), 1803-1814 (2009).
  18. Yizhar, O., et al. Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction. Nature. 477 (7363), 171-178 (2011).
  19. Berndt, A., Yizhar, O., Gunaydin, L. a., Hegemann, P., Deisseroth, K. Bi-stable neural state switches. Nat. Neurosci. 12 (2), 229-234 (2009).
  20. Berndt, A., Lee, S. Y., Ramakrishnan, C., Deisseroth, K. Structure-Guided Transformation of Channelrhodopsin into a Light-Activated Chloride Channel. Science. 344 (6182), 420-424 (2014).
  21. Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Spudich, J. L. Proteomonas sulcata ACR1: A Fast Anion Channelrhodopsin. Photochem. Photobiol. 92 (2), 257-263 (2016).
  22. Wietek, J., Broser, M., Krause, B. S., Hegemann, P. Identification of a Natural Green Light Absorbing Chloride Conducting Channelrhodopsin from Proteomonas sulcata. J. Biol. Chem. 291 (8), 4121-4127 (2016).
  23. Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Janz, R., Liu, X., Spudich, J. L. Natural light-gated anion channels: A family of microbial rhodopsins for advanced optogenetics. Science. 349 (6248), 647-650 (2015).
  24. Neher, E., Sakmann, B., Steinbach, J. H. The extracellular patch clamp: A method for resolving currents through individual open channels in biological membranes. Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. 375 (2), 219-228 (1978).
  25. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. Arch. Eur. J. Physiol. 391 (2), 85-100 (1981).
  26. Barry, P. H. JPCalc, a software package for calculating liquid junction potential corrections in patch-clamp, intracellular, epithelial and bilayer measurements and for correcting junction potential measurements. J. Neurosci. Methods. 51 (1), 107-116 (1994).
  27. Amtmann, A., Sanders, D. A unified procedure for the correction of liquid junction potentials in patch clamp experiments on endo- and plasma membranes. J. Exp. Bot. 48, 361-364 (1997).
  28. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).
  29. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. J. Vis. Exp. (63), e1-e18 (2012).
  30. Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84 (21), 7413-7417 (1987).
  31. Halliwell, J., Whitaker, M., Ogden, D. Using microelectrodes. Microelectrode Tech. Plymouth Work. Handb. 3, 1-15 (1949).
  32. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J. Vis. Exp. (20), e1-e2 (2008).
  33. Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
  34. Pusch, M., Neher, E. Rates of diffusional exchange between small cells and a measuring patch pipette. Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. 411 (2), 204-211 (1988).
  35. Prigge, M., et al. Color-tuned channelrhodopsins for multiwavelength optogenetics. J. Biol. Chem. 287 (38), 31804-31812 (2012).
  36. Gradmann, D., Berndt, A., Schneider, F., Hegemann, P. Rectification of the channelrhodopsin early conductance. Biophys. J. 101 (5), 1057-1068 (2011).
  37. Beppu, K., et al. Optogenetic countering of glial acidosis suppresses glial glutamate release and ischemic brain damage. Neuron. 81 (2), 314-320 (2014).
  38. Wietek, J., Prigge, M. Enhancing Channelrhodopsins: An Overview. Methods Mol. Biol. 1408, 141-165 (2016).
  39. Ferenczi, E. A., et al. Optogenetic approaches addressing extracellular modulation of neural excitability. Sci. Rep. 6, 1-20 (2016).
  40. Zhang, F., et al. Red-shifted optogenetic excitation: a tool for fast neural control derived from Volvox carteri. Nat. Neurosci. 11 (6), 631-633 (2008).
  41. Sugiyama, Y., et al. Photocurrent attenuation by a single polar-to-nonpolar point mutation of channelrhodopsin-2. Photochem. Photobiol. Sci. 8 (3), 328-336 (2009).
  42. Kleinlogel, S., et al. Ultra light-sensitive and fast neuronal activation with the Ca2+-permeable channelrhodopsin CatCh. Nat. Neurosci. 14 (4), 513-518 (2011).
  43. Wang, H., et al. Molecular determinants differentiating photocurrent properties of two channelrhodopsins from chlamydomonas. J. Biol. Chem. 284 (9), 5685-5696 (2009).
  44. Gradinaru, V., Thompson, K. R., Deisseroth, K. eNpHR: a Natronomonas halorhodopsin enhanced for optogenetic applications. Brain Cell Biol. 36 (1-4), 129-139 (2008).
  45. Berglund, K., et al. Luminopsins integrate opto- and chemogenetics by using physical and biological light sources for opsin activation. Proc. Natl. Acad. Sci. 113 (3), 358-367 (2016).

Play Video

Cite This Article
Grimm, C., Vierock, J., Hegemann, P., Wietek, J. Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins. J. Vis. Exp. (123), e55497, doi:10.3791/55497 (2017).

View Video