Исследование переноса мембран имеет решающее значение для понимания функций нейронов. Здесь мы вводим метод количественного определения везикулярной подвижности в нейронах. Это удобный метод, который может быть адаптирован к количественной оценке переноса мембраны в нервной системе.
В мозге системы переноса мембран играют важную роль в регулировании нейронных функций, таких как морфология нейронов, синаптичная пластичность, выживаемость и глиальные коммуникации. На сегодняшний день в многочисленных исследованиях сообщается, что дефекты в этих системах вызывают различные нейрональные заболевания. Таким образом, понимание механизмов, лежащих в основе динамики везикулы, может дать важные указания, которые могли бы помочь в лечении нескольких нейрональных нарушений. Здесь мы описываем метод количественной оценки везикулярных подвижностей, таких как дистанция подвижности и скорость движения, используя программный плагин для платформы ImageJ. Чтобы получить изображения для количественной оценки, мы пометили нейронные структуры эндосомно-лизосомы с EGFP-меченными везикулярными маркерными белками и наблюдали движение везикул с помощью микроскопии с интервалом времени. Этот метод очень полезен и упрощает измерение подвижности везикул в нейритах, таких как аксоны и дендриты, а также в соме как нейронов, так и глиальных клеток. FurthermoRe, этот метод может быть применен к другим клеточным линиям, таким как фибробласты и эндотелиальные клетки. Такой подход мог бы стать ценным прогрессом в нашем понимании переноса мембран.
Точный контроль за оборотом эндосомных лизосом необходим для регуляции функции нейронов. Примечательно, что динамические движения этих везикул являются ключевым фактором, регулирующим морфологию, развитие и выживаемость нейронов. Дефекты в этой системе вызывают тяжелые нейрональные нарушения 1 , 2 . Молекулярные механизмы, связывающие перенос везикул с заболеваниями нейронов, считаются сложными, и несколько групп пытались изучить эту актуальность. Например, сообщалось, что нарушенная подвижность концевых эндосом значительно связана с болезнью Ниманна-Пика С 3 , наследственным нейродегенеративным расстройством, вызванным дефектами лизосомы. Другим примером является мутация в лизосомальном канале Ca 2+ , trpml 1, который нарушает лизосомальную подвижность, приводя к лизосомальным заболеваниям 4 , 5 , </Sup> 6 . Наша группа сообщила, что дисрегуляция оборота PtdIns (3,5) P 2 подавляет эндосому и подвижность лизосом в нейронах, что приводит к увеличению уязвимости к стрессовому ответу 7,8 . Метаболическая регуляция PtdIns (3,5) P 2 , которая главным образом локализуется на поздних эндосомах и лизосомах, играет важную роль в широком спектре клеточных функций, включая торможение пузырьков и процессы деления слиянием-делением 9 , 10 . Так как нарушение PtdIns (3,5) P 2 вызывает тяжелую нейродегенерацию 11 , 12 , аберрантная регуляция подвижности эндосом-лизосом может быть ключевым фактором для понимания патогенеза нейродегенерации. Исследование молекулярных механизмов, лежащих в основе везикулярной подвижности, может, таким образом, давать многообещающие подсказки, которые могут углубить наше undeВыявление нескольких нейрональных нарушений.
В этой статье мы представляем ценный метод для количественной оценки везикулярной подвижности в нейронах с использованием пакета бесплатного программного обеспечения под названием «Ручное отслеживание». Целью было разработать метод быстрого количественного анализа подвижности везикул. Эта количественная оценка направлена с использованием стандартного подхода при нажатии на опорную точку в каждом кадре видеоролика с замедленным воспроизведением. Использование программного обеспечения для ручного отслеживания делает этот подход довольно простым и имеет широкую функциональность, в отличие от других приложений. Кроме того, этот подход также применим к другим клеткам, таким как глиальные клетки. Хотя этот метод примитивен, его можно применять для различных анализов, в том числе в отношении подвижности клеток и морфологических изменений. Например, после определения опорной точки по последовательности изображений информация о положениях опорных точек и времени в каждой позиции может быть извлечена из последовательных изображений, используя анализ данных и мягкую обработку изображенийпосуда. В совокупности этот метод прост, но эффективен и способствует повышению эффективности исследований, основанных на переносе мембран, таких как исследование функции эндосомы-лизосомы.
Этот протокол вводит процедуру количественного определения везикулярной подвижности. В первичных нейронах эндосомы и лизосомы имеют тенденцию демонстрировать высокую подвижность в более молодых нейронах (4-6 DIV). Учитывая, что нейроны должны доставлять некоторые компоненты к передни?…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим доктора Рикардо Долметша (Школа медицины Стэнфордского университета, нынешняя организация: Институты Новартис для биомедицинских исследований) за помощь в разработке этого анализа, а также доктора Мэтью Вуда, Такума Айхара и Донгсука Кима за их критическое чтение рукописи.
Neurobasal medium | Thermo Fisher | 21103-049 | |
Dulbecco's modified eagle medium | Wako | 044-29765 | |
Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985070 | Serum free medium |
Hank's balanced salt solution | Thermo Fisher | 14170112 | |
Penicilin Streptmycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
B-27 Supplements | Thermo Fisher | 17504044 | |
2.5% Trypsine | Thermo Fisher | 15090046 | |
poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
poly-L-ornithine | Sigma | P4957 | |
Nylon cell strainer | Corning | 431750 | |
Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 11668027 | Transfection reagent |
Polyethyleneimine "Max" | polysciences | 24765 | Transfection reagent. As an alternative to Lipofectamine2000, 0.1mg/ml Polyethyleneimine dissolved in sterilized water is available. But it is low efficiency and high toxicity. |
BIOREVO BZ-9000 | Keyence | NA | |
Incubation system INUG2-K13 | Tokay Hit | NA | |
GraphPad Prism version 6.0 | GraphPad Software | NA | |
Excel version 15 | Microsoft | NA | |
ImageJ verion 1.47 | NA | NA |