Het onderzoek naar membraanhandel is cruciaal voor het begrijpen van neuronale functies. Hier introduceren we een methode voor het kwantificeren van vesikelmotiliteit in neuronen. Dit is een handige methode die kan worden aangepast aan de kwantificering van membraanhandel in het zenuwstelsel.
In de hersenen spelen membraanhandelstelsels belangrijke rol bij het reguleren van neuronale functies, zoals neuronale morfologie, synaptische plasticiteit, overleving en glialocommunicatie. Tot op heden hebben tal van studies gemeld dat defecten in deze systemen verschillende neuronale aandoeningen veroorzaken. Zo kan het begrijpen van de mechanismen die de vesiceldynamiek onderbouwen, invloedrijke aanwijzingen verschaffen die kunnen helpen bij de behandeling van meerdere neuronale stoornissen. Hier beschrijven we een methode voor het kwantificeren van vesikelmotiliteiten, zoals de beweeglijkheidsafstand en de snelheid van beweging, met behulp van een software plug-in voor het ImageJ-platform. Om afbeeldingen te verkrijgen voor kwantificering merken we neuronale endosoom-lysosoomstructuren met EGFP-getagde vesikelmarkerproteïnen en observeerde de beweging van blaasjes met behulp van een tijdverloopmicroscopie. Deze methode is zeer nuttig en vereenvoudigt het meten van vesikelmotiliteit in neurieten, zoals axonen en dendrieten, evenals in de som van beide neuronen en gliacellen. FurthermoOpnieuw, deze methode kan worden toegepast op andere cellijnen, zoals fibroblasten en endotheliale cellen. Deze aanpak zou een waardevolle bevordering kunnen bieden van ons begrip van membraanhandel.
Een nauwkeurige controle van endosoom-lysosoomhandel is onontbeerlijk voor het reguleren van de neuronale functie. Met name de dynamische bewegingen van deze blaasjes zijn een belangrijke factor die de regulatie van neuronale morfologie, ontwikkeling en overleving onderstreept. Gebreken in dit systeem veroorzaken ernstige neuronale aandoeningen 1 , 2 . De moleculaire mechanismen die vesicale handel in neuronale aandoeningen vormen, worden beschouwd als ingewikkeld, en meerdere groepen hebben geprobeerd deze relevantie te onderzoeken. Er is bijvoorbeeld gemeld dat versteurde late endosomotiliteit significant is geassocieerd met Niemann-Pick C-ziekte 3 , een geërfde neurodegeneratieve stoornis veroorzaakt door lysosoomdefecten. Een ander voorbeeld is een mutatie in een lysosomaal Ca 2+ kanaal, trpml 1, waardoor de lysosomale motiliteit wordt aangetast, wat resulteert in lysosomale opslagziekten 4 , 5 , </Sup> 6 . Onze groep heeft gemeld dat dysregulatie van PtdIns (3,5) P 2 omzet de endosome en lysosome motiliteit in neuronen onderdrukt, wat leidt tot een toename van de kwetsbaarheid voor de stressrespons 7 , 8 . De metabolische regulering van PtdIns (3,5) P 2 , die meestal lokaliseert op late endosomen en lysosomen, speelt een belangrijke rol in een grote verscheidenheid aan cellulaire functies, waaronder vesikelhandel en fusie-splitsingsprocessen 9 , 10 . Aangezien de verminderde PtdIns (3,5) P 2 omzet ernstige neurodegeneratie 11 , 12 veroorzaakt , kan de afwijkende regulatie van endosome-lysosoommotiliteit een belangrijke factor zijn voor het begrijpen van de pathogenese van neurodegeneratie. Een onderzoek naar de moleculaire mechanismen die de vesicale motiliteit ten grondslag liggen, kunnen dus veelbelovende aanwijzingen verschaffen die onze unde kunnen verdiepenOpstanding van meerdere neuronale stoornissen.
In dit artikel introduceren we een waardevolle methode om de vesicale motiliteit in neuronen te kwantificeren met behulp van een gratis softwarepakket met de handmatige tracking. Het doel was om een snelle kwantificeringsmethode te ontwikkelen om vesikelmotiliteit te analyseren. Deze kwantificering is gericht op een standaardaanpak van het klikken op een referentiepunt in elk frame van een time-lapse film. Het gebruik van de Manual Tracking-software maakt deze aanpak vrij eenvoudig en van groot nut, in tegenstelling tot andere applicaties. Bovendien is deze aanpak ook van toepassing op andere cellen, zoals glialcellen. Hoewel deze methode primitief is, kan deze toegepast worden op verschillende analyses, waaronder cellulaire motiliteit en morfologische verandering. Bijvoorbeeld, na het definiëren van een referentiepunt over een reeks afbeeldingen, kan informatie over de posities van de referentiepunten en de tijd in elke positie worden geëxtraheerd uit sequentiële beelden met behulp van data analyse en beeldverwerking zachtware. Samenvattend is deze methode eenvoudig maar krachtig en draagt bij aan de ontwikkeling van verbeterde efficiëntie in studies op basis van membraanhandel, zoals die van endosoom-lysosoomfunctie onderzoeken.
Dit protocol introduceert de procedure voor het kwantificeren van vesikelmotiliteit. In primaire neuronen hebben endosomen en lysosomen de neiging om hoge motiliteit te tonen bij jongere neuronen (4-6 DIV). Aangezien neuronen bepaalde componenten aan de voorste randen moeten leveren om neurale processen te verlengen, moet membraanhandel dynamisch optreden tijdens dit stadium. Zo is het belangrijk om jongere neuronen te gebruiken om dynamische motiliteit in neuronale dendriten te waarnemen. Bovendien hebben grotere blaas…
The authors have nothing to disclose.
Wij bedanken dr. Ricardo Dolmetsch (Stanford University School of Medicine, huidige affiliatie: Novartis Institutes for Biomedical Research) om deze analyse te ontwikkelen en Dr. Matthew Wood, Takuma Aihara en Dongsook Kim voor hun kritische lezing van het manuscript.
Neurobasal medium | Thermo Fisher | 21103-049 | |
Dulbecco's modified eagle medium | Wako | 044-29765 | |
Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985070 | Serum free medium |
Hank's balanced salt solution | Thermo Fisher | 14170112 | |
Penicilin Streptmycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
B-27 Supplements | Thermo Fisher | 17504044 | |
2.5% Trypsine | Thermo Fisher | 15090046 | |
poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
poly-L-ornithine | Sigma | P4957 | |
Nylon cell strainer | Corning | 431750 | |
Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 11668027 | Transfection reagent |
Polyethyleneimine "Max" | polysciences | 24765 | Transfection reagent. As an alternative to Lipofectamine2000, 0.1mg/ml Polyethyleneimine dissolved in sterilized water is available. But it is low efficiency and high toxicity. |
BIOREVO BZ-9000 | Keyence | NA | |
Incubation system INUG2-K13 | Tokay Hit | NA | |
GraphPad Prism version 6.0 | GraphPad Software | NA | |
Excel version 15 | Microsoft | NA | |
ImageJ verion 1.47 | NA | NA |