Um ensaio Compatível de alta capacidade para avaliar droga Eficácia contra macrófagos passadas<em> Mycobacterium tuberculosis</em
Summary
New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.
Abstract
The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.
Introduction
A tuberculose (TB) continua a ser uma séria ameaça à saúde global, apesar da disponibilidade de regimes de quimioterapia anti-tuberculose há mais de 40 anos 1. Isto é devido em parte à exigência de períodos de tratamento longo de mais de seis meses usando várias combinações de medicamentos, o que leva a paciente a não conformidade 2. O surgimento de tuberculose resistente a medicamentos nos últimos anos tem agravado os problemas em um campo onde o desenvolvimento bem sucedido de drogas clinicamente aprovados é praticamente inexistente 3. Na verdade, apesar do desenvolvimento exaustiva de drogas anti-TB, apenas uma única droga foi aprovada pela FDA para uso clínico nos últimos 40 anos 4. Assim, as novas gerações de medicamentos anti-tuberculose são urgentemente necessárias para resolver este problema.
Um problema fundamental na descoberta TB é a falta de sucesso da transferência a partir de compostos com actividade in vitro para a eficácia no ambiente clínico= "xref"> 5, 6, 7. Inicialmente, as abordagens baseadas alvo foram utilizadas para pesquisar drogas anti-Mtb 5, que não se traduziu em células bacterianas inteiras. Mesmo quando são utilizadas células de M. tuberculosis, que é frequentemente realizada usando caldo cultivado culturas, que não prevêem com precisão a eficácia do fármaco in vivo, 8, 9. Estes problemas têm sido reconhecidas e ensaios de rastreio de drogas contra macrófagos contendo M. tuberculosis ou M. tuberculosis latente foram estabelecidas com êxito 8, 10, 11, 12. No entanto, mesmo esses ensaios mais avançados, não dão conta suficiente para as barreiras de penetração que as drogas encontram nas lesões pulmonares não vascularizados, e na focos de necrose no local da infecção. De fato, Até mesmo para a primeira linha TB rifampicina droga, a dose sub-óptima tem sido questionada devido à inadequada no tecido vivo e líquido cefalorraquidiano (LCR) penetração 13, 14, 15, bem como diminuição da eficácia contra intracelular Mtb 8, 9. Como tal, os novos modelos e ensaios que tenham em conta esses parâmetros durante o processo de desenvolvimento de liderança no início, sem dúvida, melhorar a TB esforços de descoberta de drogas.
Para atender a essa necessidade, que recentemente estabeleceu um 2 BSL-modelo de infecção barato, rápido e compatível alternativa para Mtb droga testes de eficácia 16. Este modelo de infecção produzida densamente Mtb dentro de grandes estruturas agregadas de macrófagos, que recapitulou as barreiras de penetração celular fisiologicamente relevantes e gerou macrófagos passadas <em> Mtb com um estado fisiológico alterado assemelhando-se latente Mtb. Mtb derivado deste modelo de infecção foi combinado com o ensaio de microplaca com resazurina (REMA) para avaliar a eficácia da droga, o que produziu resultados consistentes com outros modelos de infecção intracelular e bem correlacionado com a capacidade reportada das drogas comuns TB para atingir concentrações elevadas de CSF em relação às concentrações séricas 16.
Aqui nós descrevemos em detalhe a geração de Mtb / estruturas de agregação de macrófagos para produzir e macrófagos passadas Mtb apropriado para o teste de sensibilidade às drogas usando REMA. Em particular, mostra-se como este sistema de infecção poderia ser adaptado a um formato de 96 poços para compatibilidade com throughput screening de candidatos de drogas anti-TB.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, nós descrevemos em detalhe um modelo de infecção por Mtb alternativa adequada para testes de eficácia da droga. Este modelo leva em conta dois fatores-chave que devem ser dadas mais consideração durante o processo de início de desenvolvimento TB: a presença de barreiras fisiologicamente relevantes para a penetração da droga e as alterações metabólicas de Mtb durante a infecção. Embora tenhamos mostrado previamente os benefícios do nosso modelo de infecção e propôs a possibilida…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Frank Wolschendorf for access to the Cytation 3 automated imaging plate reader. This work was funded in part by NIH grant R01-AI104499 to OK. Parts of the work were performed in the UAB CFAR facilities and by the UAB CFAR Flow Cytometry Core/Joint UAB Flow Cytometry Core, which are funded by NIH/NIAID P30 AI027767 and by NIH 5P30 AR048311.
Materials
| 7H9 | BD Difco | 271310 | Follow manufacturer's recommendations |
| Middlebrook OADC | BD Biosciences | 212351 | |
| Tyloxapol | Sigma | T8761 | Prepare 20% stock solution in H2O; filter sterilize |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma | P5710 | Prepare 24 mg/ml stock solution in H2O; filter sterilize |
| L-leucine | MP Biomedicals | 194694 | Prepare 50 mg/ml stock solution in H2O; filter sterilize |
| Hygromycin B | EMD Millipore | 400051 | Prepare 200 mg/ml stock solution in H2O |
| Nalgene Square PETG media bottle | Thermo Fisher | 2019-0030 | |
| RPMI 1640 media | Hyclone | SH30027.01 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S12450H | |
| L-glutamine | Corning | MT25005CI | |
| HEPES | Hyclone | SH30237.01 | |
| Cytation 3 plate reader | Biotek | Interchangable with any fluorescent plate reader and microscope | |
| Gen5 Software | Biotek | Recording and analysis of rezasurin coversion | |
| Rifampicin | Fisher Scientific | BP2679250 | Prepare 10 mg/ml stock solution in H2O |
| Moxifloxacin Hydrochloride | Acros Organics | 457960010 | Prepare 10 mg/ml stock solution in H2O |
| Resazurin Sodium Salt | Sigma | R7017 | Prepare 800 μg/mL stock solution in H2O; filter sterilize |
| Tween-80 | Fisher Scientific | T164500 | Prepare 20% stock solution in H2O; filter sterilize |
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