Assay תואם תפוקה גבוהה כדי להעריך יעילות התרופה נגד Macrophage passaged<em> שחפת Mycobacterium</em
Summary
New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.
Abstract
The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.
Introduction
שחפת (TB) נותרה איום בריאותי הגלובלי רציני למרות הזמינות של כימותרפיה נגד שחפת במשך 40 שנה 1. זה נובע בחלקו לדרישת תקופות טיפול ארוך של למעלה מ -6 חודשים באמצעות שילובי תרופות מרובות, אשר מוביל לחולה אי קיום 2. הופעה של TB עמיד לתרופות בשנים האחרונות חריף עוד יותר בעיות בתחום שבו פיתוח מוצלח של תרופות קליניות שאושרה הנו כמעט אפסי 3. ואכן, למרות בפיתוח תרופות נגד שחפת ממצה, רק תרופה אחת כבר FDA אישר לשימוש קליני ב -40 השנים האחרונות 4. לפיכך, דורות חדשים של תרופות אנטי-TB יש צורך דחוף כדי לטפל בבעיה זו.
בעיית מפתח לגילוי סמי TB היא חוסר העברה מוצלחת תרכובות עם פעילות במבחנה יעילה במסגרת הקלינית= "Xref"> 5, 6, 7. בתחילה, גישות ה ביעדים שימשו למסך אנטי סמים חיידק השחפת 5, אשר לא הצליחו לתרגם בתאים שלמים של חיידקים. גם כאשר תאי חיידק השחפת משמשים, זה בד"כ מבוצע באמצעות תרבויות גדלו מרק, אשר לא לחזות במדויק יעילות תרופת in vivo 8, 9. בעיות אלה הוכרו מבחני מיון תרופה נגד מקרופאגים המכילים חיידקי שחפת או סמוי חיידק שחפת הוקמו 8 בהצלחה, 10, 11, 12. עם זאת, גם אלה מבחנים מתקדמים יותר לא נותנים תמורה מספקת לחסמים החדירים שתרופות נתקלות הנגעים ריאתי הלא vascularized, ובסופו של המוקדים נמקי באתר של זיהום. אכן, אפילו עבור ריפמפיצין התרופה הראשונה אונליין TB, מינון תת אופטימלית נחקר בשל לקוי ברקמות vivo ובנוזל השדרה מוחין (CSF) חדירה 13, 14, 15 וכן ירד היעילות נגד תאיים 8 MTB, 9. ככזה, מודלי מבחנים חדשים שייקחו בחשבון פרמטרים אלה במהלך תהליך פיתוח מוקדם להוביל היה ללא ספק לשפר את המאמצים לגילוי סמי TB.
כדי לתת מענה לצורך זה, הקמנו לאחרונה מודל זיהום זול, מהיר, BSL-2 תואם חלופי בדיקות יעילות תרופת חיידקי שחפת 16. מודל זיהום זה מיוצר ארוז חיידק שחפת בצפיפות בתוך מבנים המצרפי מקרופאג גדולים, אשר סכם את המחסומים חדירי הסלולר רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית שנוצר-passaged מקרופאג <em> חיידקי שחפת עם מצב פיסיולוגי שינה הדומה סמויה חיידק שחפת. חיידק השחפת נגזר ממודל זיהום זה היה בשילוב עם assay microtiter resazurin (הרמ"א) כדי להעריך יעילות התרופה, אשר הפיק תוצאות עקביות עם מודלים זיהום תאיים אחרים בקורלציה גם עם היכולת דיווח של סמים TB נפוצה מנת להגיע לריכוזי CSF גבוהה ביחס ריכוזים בסרום 16.
כאן אנו מתארים בפרוטרוט את הדור של חיידק השחפת / מבנים המצרפי מקרופאג לייצר-passaged מקרופאג חיידק השחפת מתאים בדיקות רגישות סמים באמצעות הרמ"א. בפרט, אנו מראים כיצד מערכת זיהום זה יכול להיות מותאם בפורמט 96-גם עבור תאימות עם התפוקה ההקרנה של תרופות נוגדות-TB מועמד.
Protocol
Representative Results
Discussion
הנה, יש לנו תיאר בפרוטרוט מודל חלופי בחיידק השחפת זיהום מתאים בדיקות יעילות התרופה. מודל זה לוקח בחשבון שני גורמים מרכזיים שיש לתת את דעת יותר במהלך תהליך פיתוח תרופות TB מוקדם: הנוכחות של מחסומים רלוונטיים מבחינה הפיזיולוגית לחדירה בסמי שינויים מטבוליים של חי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Frank Wolschendorf for access to the Cytation 3 automated imaging plate reader. This work was funded in part by NIH grant R01-AI104499 to OK. Parts of the work were performed in the UAB CFAR facilities and by the UAB CFAR Flow Cytometry Core/Joint UAB Flow Cytometry Core, which are funded by NIH/NIAID P30 AI027767 and by NIH 5P30 AR048311.
Materials
| 7H9 | BD Difco | 271310 | Follow manufacturer's recommendations |
| Middlebrook OADC | BD Biosciences | 212351 | |
| Tyloxapol | Sigma | T8761 | Prepare 20% stock solution in H2O; filter sterilize |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma | P5710 | Prepare 24 mg/ml stock solution in H2O; filter sterilize |
| L-leucine | MP Biomedicals | 194694 | Prepare 50 mg/ml stock solution in H2O; filter sterilize |
| Hygromycin B | EMD Millipore | 400051 | Prepare 200 mg/ml stock solution in H2O |
| Nalgene Square PETG media bottle | Thermo Fisher | 2019-0030 | |
| RPMI 1640 media | Hyclone | SH30027.01 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S12450H | |
| L-glutamine | Corning | MT25005CI | |
| HEPES | Hyclone | SH30237.01 | |
| Cytation 3 plate reader | Biotek | Interchangable with any fluorescent plate reader and microscope | |
| Gen5 Software | Biotek | Recording and analysis of rezasurin coversion | |
| Rifampicin | Fisher Scientific | BP2679250 | Prepare 10 mg/ml stock solution in H2O |
| Moxifloxacin Hydrochloride | Acros Organics | 457960010 | Prepare 10 mg/ml stock solution in H2O |
| Resazurin Sodium Salt | Sigma | R7017 | Prepare 800 μg/mL stock solution in H2O; filter sterilize |
| Tween-80 | Fisher Scientific | T164500 | Prepare 20% stock solution in H2O; filter sterilize |
References
- Barry, C. E. Lessons from seven decades of antituberculosis drug discovery. Curr Top Med Chem. 11 (10), 1216-1225 (2011).
- Bass, J. B., et al. Treatment of tuberculosis and tuberculosis infection in adults and children. American Thoracic Society and The Centers for Disease Control and Prevention. Am J Respir Crit Care Med. 149 (5), 1359-1374 (1994).
- Koul, A., Arnoult, E., Lounis, N., Guillemont, J., Andries, K. The challenge of new drug discovery for tuberculosis. Nature. 469 (7331), 483-490 (2011).
- Palomino, J. C., Martin, A. TMC207 becomes bedaquiline, a new anti-TB drug. Future Microbiol. 8 (9), 1071-1080 (2013).
- Zuniga, E. S., Early, J., Parish, T. The future for early-stage tuberculosis drug discovery. Future Microbiol. 10 (2), 217-229 (2015).
- Evangelopoulos, D., Fonseca, d. a., D, J., Waddell, S. J. Understanding anti-tuberculosis drug efficacy: rethinking bacterial populations and how we model them. Int J Infect Dis. 32, 76-80 (2015).
- Ekins, S., et al. Looking back to the future: predicting in vivo efficacy of small molecules versus Mycobacterium tuberculosis. J Chem Inf Model. 54 (4), 1070-1082 (2014).
- Christophe, T., et al. High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2′ epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors. PLoS Pathog. 5 (10), e1000645 (2009).
- Hartkoorn, R. C., et al. Differential drug susceptibility of intracellular and extracellular tuberculosis, and the impact of P-glycoprotein. Tuberculosis (Edinb). 87 (3), 248-255 (2007).
- Queval, C. J., et al. A microscopic phenotypic assay for the quantification of intracellular mycobacteria adapted for high-throughput/high-content screening. J Vis Exp. (83), e51114 (2014).
- Sorrentino, F., et al. Development of an intracellular screen for new compounds able to inhibit Mycobacterium tuberculosis growth in human macrophages. Antimicrob Agents Chemother. 60 (1), (2015).
- Sarathy, J., Dartois, V., Dick, T., Gengenbacher, M. Reduced drug uptake in phenotypically resistant nutrient-starved nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 57 (4), 1648-1653 (2013).
- Dutta, N. K., Karakousis, P. C. Can the duration of tuberculosis treatment be shortened with higher dosages of rifampicin?. Front Microbiol. 6, 1117 (2015).
- van Ingen, J., et al. Why Do We Use 600 mg of Rifampicin in Tuberculosis Treatment?. Clin Infect Dis. 52 (9), e194-e199 (2011).
- Donald, P. R. Cerebrospinal fluid concentrations of antituberculosis agents in adults and children. Tuberculosis (Edinb). 90 (5), 279-292 (2010).
- Schaaf, K., et al. A Macrophage Infection Model to Predict Drug Efficacy Against Mycobacterium Tuberculosis. Assay Drug Dev Technol. 14 (6), 345-354 (2016).
- Sampson, S. L., et al. Protection elicited by a double leucine and pantothenate auxotroph of Mycobacterium tuberculosis in guinea pigs. Infect Immun. 72 (5), 3031-3037 (2004).
- Jain, P., et al. Specialized transduction designed for precise high-throughput unmarked deletions in Mycobacterium tuberculosis. MBio. 5 (3), e01245-e01214 (2014).
- Davis, J. M., Ramakrishnan, L. The role of the granuloma in expansion and dissemination of early tuberculous infection. Cell. 136 (1), 37-49 (2009).
- Collins, L., Franzblau, S. G. Microplate alamar blue assay versus BACTEC 460 system for high-throughput screening of compounds against Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium. Antimicrob Agents Chemother. 41 (5), 1004-1009 (1997).
- Snewin, V. A., et al. Assessment of immunity to mycobacterial infection with luciferase reporter constructs. Infect Immun. 67 (9), 4586-4593 (1999).
