Isolamento, caratterizzazione e purificazione dei macrofagi dai tessuti colpiti da infiammazione obesità
Summary
Questo protocollo consente un ricercatore di isolare e caratterizzare residente in tessuto hallmark macrofagi in vari tessuti infiammati estratte dai modelli indotta da dieta di disordini metabolici.
Abstract
L’obesità favorisce uno stato infiammatorio cronico che è in gran parte mediato dai macrofagi residenti in tessuto così come macrofagi monocito-derivati. L’obesità indotta da dieta (DIO) è un modello importante nello studio del ruolo di eterogeneità dei macrofagi; Tuttavia, gli isolamenti del macrofago adeguata sono difficili da acquisire da tessuti infiammati. In questo protocollo, vengono delineati i passaggi di isolamento e le necessarie linee guida sulla risoluzione dei problemi derivate dai nostri studi per l’ottenimento di una popolazione adatta dei macrofagi residenti in tessuto da topi dopo 18 settimane di grassi (HFD) o alto-grasso/colesterolo ( Intervento di dieta HFHCD). Questo protocollo si concentra su tre hallmark tessuti studiati nell’obesità e aterosclerosi compreso il fegato, tessuto adiposo bianco (WAT) e l’aorta. Evidenziamo l’utilizzo come dualistica di flusso cytometry può raggiungere una nuova dimensione di isolamento e caratterizzazione dei macrofagi residenti in tessuto. Una sezione fondamentale del presente protocollo risolve la complessità sottostante digestioni enzimatiche tessuto-specifici e isolamento del macrofago e successiva anticorpo cellula-superficie che macchia per analisi cytometric di flusso. Questo protocollo consente di risolvere complessità esistente alla base fluorescente-attivata delle cellule ordinano (FACS) e presenta chiarimenti a queste complessità in modo da ottenere la caratterizzazione di vasta gamma da popolazioni cellulari adeguatamente ordinato. Metodi di arricchimento alternativo sono inclusi per l’ordinamento di cellule, quali il fegato denso, consentendo per la gestione di tempo e flessibilità quando si lavora con FACS. In breve, questo protocollo aiuti al ricercatore di valutare l’eterogeneità dei macrofagi da una moltitudine di tessuti infiammati in un dato studio e fornisce penetranti suggerimenti sulla risoluzione dei problemi che hanno avuto successo per la caratterizzazione e isolamento cellulare favorevole delle cellule immuni in DIO-ha mediato l’infiammazione.
Introduction
Modelli murini sono stati ampiamente utilizzati per studiare la dinamica delle malattie umane. Adeguato isolamento delle cellule residenti del tessuto da topi in uno stato malato può fornire una piattaforma per comprendere i contributi molecolari e cellulari alla patogenesi di una malattia1. Un disordine che è di fondamentale importanza è l’obesità. L’incidenza dell’obesità continua ad aumentare in tutto il mondo in parallelo con l’insulino-resistenza e di tipo 2 mellitus del diabete, malattia cardiovascolare e steatosi epatica2,3. Eccessivo consumo di nutrienti è ulteriormente inclinato da riduzione dell’attività fisica innescando segnali alterati provenienti dal tessuto adiposo, che può alterare l’ambiente cellulare degli altri tessuti periferici quali l’aorta e fegato4. Tale perturbazione dell’omeostasi metabolica si traduce in un di infiammazione sistemica cronica di basso grado5.
Classica attivazione dei macrofagi residenti per l’aorta e fegato, nonché il loro reclutamento al tessuto adiposo bianco (WAT) ha dimostrato di non solo avviare il dysregulation di segnali metabolici, ma anche sostenere l’infiammazione6,7. L’eterogeneità fenotipica e funzionale dei macrofagi è fortemente associato con la patogenesi dell’obesità correlate a co-morbidità7. La plasticità dinamica nella polarizzazione del macrofago consente queste cellule ad esporre una gamma di fenotipi attivati che coordinano la progressione e la risoluzione di infiammazione8. Mentre i macrofagi (M1) classicamente attivati sono implicati nella propagazione dell’infiammazione, i macrofagi (M2) in alternativa attivati sono stati associati con risoluzione e tessuto riparazione9,10.
Come il corpo subisce stress metabolico, tessuto adiposo bianco si accumula in modo anomalo. Il tessuto adiposo espanso attira e trattiene le cellule infiammatorie che profondo alterano la normale funzione degli adipociti per promuovere l’insulino-resistenza, iperglicemia e diabete mellito di tipo 2 in ultima analisi, l’insulino-resistenza o iperglicemia11, 12. In parallelo, tessuto adiposo bianco rimodella in risposta a segnali infiammatori rilasciato da infiltrato classicamente attivati (M1) tessuto adiposo macrofagi (ATMs)13,14. Questo organo multi-cellulare esercita una cascata di segnali che deraglia la normale funzione di altri organi del corpo come l’aorta e fegato4.
Il fegato è un concentrato di metabolico che si adatta in risposta a stimoli provenienti da vicine dysregulated WAT15. Epatici macrofagi o cellule di Kupffer, in risposta a cambiamenti metabolici, secernono citochine infiammatorie che trasformano entrambi parenchimatica e fenotipo delle cellule non parenchimali e promuovono il rimodellamento tissutale. Accumulo di lipidi epatici, infiammazione, depositi eccessivi di matrice extracellulare, necrosi e funzione eventuale perdita segue gli insulti infiammatori contribuendo ad ampio spettro di danni al fegato associati con epatopatia steatosica non alcolica 16,17,18.
In parallelo al compromesso WAT e funzione epatica, grandi arterie si accumulano i lipidi all’interno della parete arteriosa come il corpo subisce lo stress metabolico cronico19. Accumulazione del lipido arteriosa innesca la secrezione di chemochine dalle cellule endoteliali attivate e successiva assunzione di monociti20. Una volta reclutate, monociti proliferano, differenziano, ingeriscono lipoproteine e diventano cellule della gomma piuma. Atherogenesis è avviata e sostenuta da attività pro-infiammatoria di reclutati e macrofagi lipido-carichi residente in tessuto. Soccombere ai segnali extracellulari ed intracellulari stress inoltrati in questo microambiente atherogenic, questi macrofagi quindi impegnano in una cascata di segnalazione di apoptotic. Come queste cellule schiumose muoiono, essi contribuiscono loro contenuto lipidico riempito al nucleo necrotico della lesione, che poi conduce alla rottura della placca, infarto miocardico e ictus.
Collettivamente, l’eterogeneità fenotipica del macrofago orchestra in parte l’obesità indotta da cambiamenti infiammatori osservati in tessuti dysregulated come WAT, fegato e dell’aorta8,21. Caratterizzazione di reclutati e macrofagi residenti tessuto potrebbero fornire la comprensione nei potenziali bersagli molecolari che manipolano macrofago fenotipo1. Per caratterizzare in modo efficace i macrofagi dai tessuti infiammati obesità-indotta, una sospensione di singola cellula può essere ottenuta tramite digestione enzimatica. Tali protocolli di dissociazione devono essere efficace nel sufficientemente degradante tessuto connettivo riducendo la morte delle cellule immuni e fornendo resa cellulare ottimale. La miscela di enzimi dipende dal tipo di tessuto e suo strutturale compongono. Tessuti resistenti, come l’aorta richiede più forte attività enzimatica, rispetto al fegato e WAT, per raggiungere la dissociazione dei tessuti. Dalla sospensione unicellulare, macrofagi residenti del tessuto possono essere inequivocabilmente caratterizzati o isolati per ulteriore analisi, a valle quali profiling trascrizionale.
Qui un protocollo di tessuto-specifico è descritto che utilizza la digestione della collagenosi-dipendente del tessuto e citometria a flusso policromatici efficacemente isolare e caratterizzare i macrofagi residenti in tessuto ottenuti da obesità dieta tradizionale ha indotto, aterosclerosi, semplice steatosi e steatoepatite modelli murini. Simultanea di colorazione degli indicatori della superficie delle cellule con anticorpi contro del leucocita-(CD45 e/o CD11b) e del macrofago – antigeni specifici (F4/80) è spesso utilizzato per identificare il macrofago popolazioni22. Fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS) sono una strategia potente utilizzata per ordinare queste popolazioni identificate a elevata purezza. La popolazione ordinata quindi possa essere valutata per profili di gene specifico fenotipo mediante analisi molecolare a valle (ad esempio, reazione a catena della polimerasi quantitativa real time)23. Sebbene la citometria a flusso standard e flusso cytometry-base cella ordinamento sono strumenti potenti nel distinguere i macrofagi all’interno di una sospensione cellulare notevolmente eterogenei, i protocolli ex devono essere ottimizzati per garantire successo uscita. In questo studio, protocolli che efficacemente isolare e caratterizzano i macrofagi specifico tessuto vitale sono descritti; ancora più importante, questo studio fornisce approfondimenti cruciali di questioni tecniche che spesso sorgono, così come le strategie proattive e Trouble-Shooting per prevenire e/o risolverli.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modelli di malattia metabolica indotta da dieta che imitano co-morbidità, quali aterosclerosi, semplice steatosi e steatoepatite e diabete di tipo 2 sono ampiamente utilizzati per comprendere meglio i meccanismi molecolari della progressione di malattia. Dipendente dalla digestione della collagenosi viene spesso utilizzata per dissociare tessuti per liberare le cellule dalla matrice extracellulare (ECM)16,27. Enzimi quali la collagenasi perturbare collagene che …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare il flusso Cytometry Core Facility presso The Pennsylvania State University Millennium scienza complessa.
Materials
| 26G x 5/8 in Needles | BD | 305115 | |
| 23G x 0.75 in needle x 12 in. tubing Blood Collection Set | BD | 367297 | Used for cannulation of subhepatic IVC during liver perfusion |
| 21G 1 1/2 in. Needles | BD | 305156 | |
| 1mL syringe with rubber stops | BD | 309659 | |
| 10mL Syringes | BD | 309604 | |
| 1mL Syringe | BD | 309659 | |
| F4/80 PE | Biolegend | 123110 | |
| CD11c PE/Cy7 | Biolegend | 117318 | |
| CD11b PE/Cy5 | eBioscience | 15-0112-81 | |
| Anti-mouse CD16/32 Fc Block | Biolegend | 101320 | |
| CD45 Pacific Blue | Biolegend | 103126 | |
| PE Rat IgG2a | Biolegend | 400508 | |
| PE/Cy7 Armenian Hamster IgG | Biolegend | 400922 | |
| PE/Cy5 Rat IgG2b | Biolegend | 400610 | |
| Pacific Blue Rat IgG2c | Biolegend | 400717 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Cellgro | 15-017-CV | |
| 1X Phosphate Buffered Saline (PBS) | Cellgro | 21-031-CV | |
| 70 micron cell strainers | Corning, Inc. | 352350 | |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Denville | C2170 | |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution -16X | Electron Microscopy Sciences | CAS #30525-89-4 | |
| Micro Dissecting Scissors, 3.5 inch, Straight, 23mm, Sharp | Stoelting | 52132-10P | Used for general dissecting purposes |
| Micro Forceps, 4in, full curve, 0.8mm | Stoelting | 52102-37P | Used for general dissecting purposes |
| Spring dissection scissors – 3 mm Cutting edge | Fine Science Tool | 15000-10 | Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28 |
| Curved 0.07 x 0.04 mm Tip Forceps | Fine Science Tool | 11297-10 | Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28 |
| Hemostatic Forceps (Curved) | Fine Science Tool | 13021-12 | |
| Heparin Sodium Salt | Fischer Scientific | 9041-08-1 | |
| 35mm Cell Culture/Petri Dishes | Fischer Scientific | 12-565-90 | |
| Polystyrene Petri Dishes (10 cm) w/lid | Fischer Scientific | 08-757-100D | |
| 15mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene) | Fischer Scientific | 14-959-53A | |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene) | Fischer Scientific | 14-432-22 | |
| 5mL Round-Bottom Polystyrene Tubes | Fischer Scientific | 14-959-5 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| Ethanol (Stock Ethyl Alcohol Denatured, Anyhydrous) | Millipore | EX0285-1 | |
| Bovine Serum Albumin | Rockland | BSA-50 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Collagenase Type II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| Collagenasse Type XI | Sigma-Aldrich | C7657 | |
| Hyaluronidase Type I | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Collagenase Type I | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| NaOH | Sigma Aldrich | 1310-73-2 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | 449709-10G | |
| 500mL beaker | Sigma Aldrich | 02-540M | |
| 4 cm Hemostatic clamp | Stoelting | 52120-40 | |
| Toothed forceps | Stoelting | 52104-33P | |
| 50 micron Disposable filters | Systemex | 04-0042-2317 | |
| Collagenase Type IV | ThermoFischer Scientific | 17104019 | |
| Ammonium Chloride Potassium (ACK) | ThermoFischer Scientific | A1049201 | |
| Razors (0.22 mm (0.009")) | VWR International | 55411-050 | |
| Texas Red Live/Dead stain | Red viability stain (in Figure 1A) |
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