Summary

Isolierung, Charakterisierung und Reinigung der Makrophagen aus den Geweben von Fettleibigkeit bedingte Entzündung betroffen

Published: April 03, 2017
doi:

Summary

Dieses Protokoll ermöglicht ein Forscher zu isolieren und zu charakterisieren, Gewebe-Bewohner Makrophagen in verschiedenen hallmark entzündetem Gewebe extrahiert aus Diät-induzierten Modelle der Stoffwechselstörungen.

Abstract

Übergewicht fördert einen chronische entzündlichen Zustand, der weitgehend durch Gewebe-Bewohner Makrophagen sowie Monocyte abgeleiteten Makrophagen vermittelt wird. Diät-induzierten Adipositas (DIO) ist ein wertvolles Modell bei der Untersuchung der Rolle der Makrophagen Heterogenität; angemessene Makrophagen Isolationen sind jedoch schwierig, von entzündetem Gewebe zu erwerben. In diesem Protokoll beschreiben wir die Isolierung Schritte und notwendigen Lösungsanleitungen stammen aus unseren Studien eine geeignete Bevölkerung von Gewebe-Bewohner Makrophagen von Mäusen nach 18 Wochen der fettreichen (HFD) oder High-Fat/High-Cholesterin (einzuholen HFHCD) Diät Intervention. Dieses Protokoll konzentriert sich auf drei Markenzeichen Gewebe untersucht Adipositas und Arteriosklerose einschließlich der Leber, weißen Fettgewebe (WAT) und der Aorta. Wir markieren wie dualistische Nutzung des Flow Cytometry erreichen eine neue Dimension der Isolierung und Charakterisierung von Gewebe-Bewohner Makrophagen. Ein grundlegenden Abschnitt dieses Protokolls befasst sich mit die Feinheiten gewebespezifischen enzymatischen Verdauung und Makrophagen Isolierung und anschließende Zelloberfläche Antikörper Färbung für durchflusszytometrischen Analyse zugrunde liegen. Dieses Protokoll befasst sich mit vorhandenen Komplexität zugrunde liegende fluoreszierende aktiviert Zelle sortieren (FACS) und enthält Erläuterungen zu diesen komplexen Problemen um breite Palette Charakterisierung von angemessen sortierte Zellpopulationen zu erhalten. Dazu gehören Alternative Anreicherungsverfahren für das Sortieren von Zellen, wie die dichten Leber, ermöglichen Flexibilität und Zeit bei der Arbeit mit FACS. Kurz gesagt, dieses Protokoll aids-Forscher, Makrophagen Heterogenität aus einer Vielzahl von entzündetem Gewebe in einer bestimmten Studie zu bewerten und liefert aufschlussreiche Tipps zur Problembehandlung, die erfolgreich für günstige zellulären Isolierung und Charakterisierung von Immunzellen in DIO-vermittelte Entzündung.

Introduction

Maus-Modellen sind weitgehend benutzt worden, um die Dynamik der menschlichen Krankheiten zu studieren. Richtige Isolierung der ansässigen Gewebezellen von Mäusen in einem kranken Zustand kann eine Plattform bieten, für das Verständnis der molekularen und zellulären Beiträge zur Pathogenese einer Krankheit1. Eine Störung, die von entscheidender Bedeutung ist Übergewicht. Die Inzidenz der Adipositas weiter steigen weltweit parallel mit Insulinresistenz und Typ-2 Diabetes Mellitus, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Fettleber2,3. Übermäßiger Konsum Nährstoff ist weiter verzerrt durch verminderte körperliche Aktivität auslösen veränderten Signale aus Fettgewebe, die das zelluläre Milieu von anderen peripheren Geweben wie der Aorta und Leber4verändern können. Solche Störungen der metabolischen Homöostase führt eine chronische niedriggradigen systemischen Entzündung5.

Klassische Aktivierung von Makrophagen wohnhaft sind, um die Aorta und Leber sowie ihre Einstellung zu weißen Fettgewebe (WAT) nachweislich nicht nur Dysregulation von metabolischen Signalen zu initiieren, sondern auch nachhaltig Entzündung6,7. Die phänotypische und funktionelle Heterogenität von Makrophagen ist stark verbunden mit der Entstehung von Übergewicht im Zusammenhang mit Komorbiditäten7. Die dynamische Plastizität in Makrophagen Polarisierung ermöglicht diese Zellen eine Reihe von aktivierten Phänotypen, die das Fortschreiten zu koordinieren und Auflösung der Entzündung8auszustellen. Während klassisch aktivierte Makrophagen (M1) in der Ausbreitung der Entzündung beteiligt sind, wurden Alternativ aktivierte Makrophagen (M2) mit Auflösung und Gewebe Reparatur9,10verbunden.

Wie der Körper metabolische Belastung erfährt, sammelt sich ungewöhnlich weißen Fettgewebe. Das erweiterte Fettgewebe anzieht und behält sich Entzündungszellen, die normalen Adipocyte Funktion zur Förderung der Insulinresistenz, Hyperglykämie und letztlich Typ-2 Diabetes Mellitus, Insulin-Resistenz oder Hyperglykämie11tiefgreifend verändern, 12. Parallel infiltriert weißen Fettgewebe umbaut in Reaktion auf inflammatorische Signale veröffentlicht von klassisch aktivierte (M1) Fettgewebe Makrophagen (ATMs)13,14. Diese mehrzellige Organ übt eine Kaskade von Signalen, die die normale Funktion der anderen Organe des Körpers wie die Aorta und Leber4entgleist.

Die Leber ist eine metabolische Kraftwerk, das als Reaktion auf Reize aus nahe gelegenen Dysregulated WAT15passt. Hepatische Makrophagen oder Kupffer Zellen als Reaktion auf metabolische Veränderungen, sezernieren inflammatorischen Zytokinen, die beide parenchymatösen verwandeln und nicht parenchymatösen Zelle Phänotyp und fördern Gewebe umgestaltet. Hepatische Lipid Akkumulation, Entzündung, übermäßige extrazelluläre Matrix Einlagen, Nekrose und eventuelle Funktion Verlust folgt die entzündlichen Beleidigungen beitragen, das breite Spektrum der Leberschäden im Zusammenhang mit nicht-alkoholische Fettleber 16,17,18.

Parallel zu kompromittierten WAT und Leberfunktion akkumulieren große Arterien Lipiden in der Arterienwand, wie der Körper chronischer metabolischer Stress19 erfährt. Arterielle Lipid Ansammlung löst die Sekretion von Chemokinen durch aktivierten Endothelzellen und spätere Rekrutierung von Monozyten20. Einmal eingestellt, vermehren Monozyten, differenzieren, Lipoproteine aufnehmen und zu Schaumzellen. Atherogenese initiiert und getragen von der Pro-inflammatorischen Aktivität von rekrutiert und Gewebe resident Lipid-beladene Makrophagen. Die extrazellulären und intrazellulären Stress-Signale weitergeleitet in diesem atherogenic Mikroumgebung erliegen, diese Makrophagen dann in eine Signalkaskade Apoptotic engagieren. Wenn diese Schaumzellen sterben, tragen sie ihre Lipid gefüllt Inhalte zum nekrotischen Kern der Läsion, die dann zu Plaque Ruptur, Herzinfarkt und Schlaganfall führt.

Die Heterogenität der Makrophagen Phänotypen orchestriert Kollektiv, teilweise die Adipositas induziert durch entzündliche Veränderungen in Dysregulated Gewebe wie WAT, Leber und Aorta8,21. Charakterisierung von rekrutiert und resident Gewebe Makrophagen konnte Einblick in mögliche molekulare Targets, die Makrophagen Phänotyp1bearbeiten. Um Makrophagen von Adipositas-induzierte entzündetem Gewebe effektiv zu charakterisieren, erhalten Sie eine einzellige Suspension durch enzymatische Verdauung. Solche Protokolle Dissoziation müssen ausreichend erniedrigende Bindegewebe bei gleichzeitiger Minimierung immun Zelltod und bietet optimale Zellausbeute wirksam. Die Enzym-Mischung ist abhängig von der Art des Gewebes und seiner strukturellen Make-up. Elastische Gewebe wie der Aorta erfordert stärkere enzymatische Aktivität im Vergleich zu der Leber und WAT Gewebe Dissoziation zu erreichen. Aus der Einzelzelle Suspension können Gewebe resident Makrophagen eindeutig gekennzeichnet oder isoliert für weitere nachgelagerte Analysen wie transkriptionelle Profilierung.

Hier ist eine gewebespezifische Protokoll beschrieben, die Kollagenase-abhängige Gewebe Verdauung und polychromatische Durchflusszytometrie verwendet, um effektiv zu isolieren und zu charakterisieren Gewebe-Bewohner Makrophagen aus traditionellen Ernährung induzierten Adipositas gewonnen, Arteriosklerose, einfache Steatose und Steatohepatitis Mausmodellen. Gleichzeitige Färbung der Zelle Oberflächenmarker mit Antikörpern gegen Leukozyten-(CD45 und/oder CD11b) und Makrophagen – spezifische Antigene (F4/80) wird häufig verwendet um Makrophagen Populationen22zu identifizieren. Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS) ist eine wirkungsvolle Strategie verwendet, um diese identifizierten Populationen in hoher Reinheit zu sortieren. Die sortierte Bevölkerung kann dann für Phänotyp spezifischen Gen-Profile mit nachgeschalteten molekulare Analyse (z. B. quantitative Real-Time Polymerase-Kettenreaktion)23ausgewertet werden. Obwohl standard Durchflusszytometrie und Flow Cytometry-basierte Zellsortierung mächtige Werkzeuge in Makrophagen in einem stark heterogenen Zellsuspension zu unterscheiden sind, müssen der ehemaligen Protokolle optimiert werden, um erfolgreichen Ausgang zu gewährleisten. In dieser Studie sind Protokolle, die effektiv zu isolieren und zu charakterisieren bestimmte tragfähige Gewebe Makrophagen beschrieben; noch wichtiger ist, bietet diese Studie entscheidende Einblicke in technische Probleme, die häufig sowie proaktive und Fehlersuche Strategien zu verhindern bzw. zu lösen auftreten.

Protocol

Alle experimentelle Protokolle (Abschnitte 1, 1.2 und 1.3) stimmten mit den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) an der Pennsylvania State University. Gewebe Dissoziation-Puffer-Vorbereitung Endvolumen Lagerung Weißen Fettgewebe (WAT) Dissoziation Puffer: 2,5 % HEPES, 10 mg/mL Rinderser…

Representative Results

Bei der Verwendung von Apolipoprotein E mangelhaft (ApoE KO) C57BL/6 (BL6) Mäuse auf einem hohen Fett hohe Cholesterin-Diät (HCHFD oder HCD) für 18 Wochen, 1 x 10-4 – 2 x 104 CD45 gepflegt+F4/80+ Aorten Makrophagen können isoliert werden, wenn zwei Proben zusammengefasst. Lebern von HFHCD gefütterten ApoE KO Mäusen seziert produziert größer als 5 x 105 sortiert Kupffer Zellen (die Sortierung zur Verfügung stehende Zeit abhän…

Discussion

Diät-induzierten Stoffwechselstörung Modelle, die Komorbiditäten wie Atherosklerose, einfache Steatose, Steatohepatitis zu imitieren und Typ-2-Diabetes, sind weitgehend verwendet, um die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der Progression der Erkrankung besser zu verstehen. Kollagenase abhängigen Verdauung wird häufig verwendet, Gewebe, Zellen aus der extrazellulären Matrix (ECM)16,27zu befreien zu distanzieren. Enzyme wie Kollagenase stören Kollage…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir möchten den Flow Cytometry Core Facility in The Pennsylvania State University Millennium Science Complex danken.

Materials

26G x 5/8 in Needles BD 305115
23G x 0.75 in needle x 12 in. tubing Blood Collection Set BD 367297 Used for cannulation of subhepatic IVC during liver perfusion
21G 1 1/2 in. Needles BD 305156
1mL syringe with rubber stops BD 309659
10mL Syringes BD 309604
1mL Syringe BD 309659
F4/80 PE Biolegend 123110
CD11c PE/Cy7 Biolegend 117318
CD11b PE/Cy5 eBioscience 15-0112-81
Anti-mouse CD16/32 Fc Block  Biolegend 101320
CD45 Pacific Blue Biolegend 103126
PE Rat IgG2a Biolegend 400508
PE/Cy7 Armenian Hamster IgG Biolegend 400922
PE/Cy5 Rat IgG2b Biolegend 400610
Pacific Blue Rat IgG2c Biolegend 400717
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)  Cellgro 15-017-CV
1X Phosphate Buffered Saline (PBS) Cellgro 21-031-CV
70 micron cell strainers Corning, Inc. 352350
 1.7 mL microcentrifuge tube  Denville C2170
Paraformaldehyde Aqueous Solution -16X Electron Microscopy Sciences CAS #30525-89-4
Micro Dissecting Scissors, 3.5 inch, Straight, 23mm, Sharp  Stoelting 52132-10P Used for general dissecting purposes
Micro Forceps, 4in, full curve, 0.8mm Stoelting 52102-37P  Used for general dissecting purposes
Spring dissection scissors – 3 mm Cutting edge  Fine Science Tool 15000-10 Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28
Curved 0.07 x 0.04 mm Tip Forceps  Fine Science Tool 11297-10 Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28
Hemostatic Forceps (Curved) Fine Science Tool 13021-12
Heparin Sodium Salt Fischer Scientific 9041-08-1
35mm Cell Culture/Petri Dishes Fischer Scientific 12-565-90
Polystyrene Petri Dishes (10 cm) w/lid Fischer Scientific 08-757-100D
15mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene) Fischer Scientific 14-959-53A
50mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene) Fischer Scientific 14-432-22
5mL Round-Bottom Polystyrene Tubes  Fischer Scientific 14-959-5
Fetal Bovine Serum Gemini Bio-Products 100-106
Ethanol (Stock Ethyl Alcohol Denatured, Anyhydrous) Millipore EX0285-1
Bovine Serum Albumin Rockland BSA-50
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Collagenase Type II Sigma-Aldrich C6885
Collagenasse Type XI Sigma-Aldrich C7657
Hyaluronidase Type I Sigma-Aldrich H3506
DNAse Sigma-Aldrich DN25
Collagenase Type I Sigma-Aldrich C0130
NaOH Sigma Aldrich 1310-73-2 
CaCl2 Sigma Aldrich 449709-10G
500mL beaker  Sigma Aldrich 02-540M
4 cm Hemostatic clamp Stoelting 52120-40
Toothed forceps Stoelting 52104-33P
50 micron Disposable filters Systemex 04-0042-2317
Collagenase Type IV ThermoFischer Scientific 17104019
Ammonium Chloride Potassium (ACK) ThermoFischer Scientific  A1049201
Razors (0.22 mm (0.009")) VWR International 55411-050
Texas Red Live/Dead stain Red viability stain (in Figure 1A)

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Allen, J. N., Dey, A., Nissly, R., Fraser, J., Yu, S., Balandaram, G., Peters, J. M., Hankey-Giblin, P. A. Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation. J. Vis. Exp. (122), e55445, doi:10.3791/55445 (2017).

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