Aqui, nós fornecemos um, de baixo custo fácil, e protocolo de tempo-eficiente para corrigir quimicamente o tecido cerebral dos primatas com fixador acroleína, permitindo a preservação a longo prazo que seja compatível com imunohistoquímica pré-incorporação para microscopia eletrônica de transmissão.
Apesar de todos os avanços tecnológicos ao nível da microscopia de luz, microscopia eletrônica continua a ser a única ferramenta em neurociência para analisar e caracterizar detalhes ultra-estruturais e morfológicas de neurônios, como contatos sinápticos. Boa preservação do tecido cerebral para microscopia eletrônica pode ser obtida por métodos de crio-fixação rigorosos, mas essas técnicas são bastante caro e limitar o uso de imunomarcação, que é crucial para entender a conectividade dos sistemas neuronais identificados. métodos de congelação-substituição têm sido desenvolvidos para permitir que a combinação de crio-fixação com imunomarcação. No entanto, a reprodutibilidade dessas abordagens metodológicas geralmente se baseia em dispositivos de congelamento caros. Além disso, a obtenção de resultados confiáveis com esta técnica é muito demorado e desafiador habilidade. Assim, o cérebro quimicamente fixo tradicional, especialmente com fixador acroleína, continua a ser um método tempo-eficiente e de baixo custo para combinar electrõesmicroscopia com imuno-histoquímica. Aqui, nós fornecemos um protocolo experimental de confiança utilizando a fixação de acroleína química que conduz para a preservação do tecido do cérebro primata e é compatível com o pré-incorporação exame microscópico imuno-histoquímica e de transmissão de electrões.
Microscopia de luz, incluindo confocal e microscopia de dois fótons, provou ser uma ferramenta eficiente para estudar em processos neuronais in vivo, entre outras coisas 1, 2. Embora a resolução espacial típico no nível de luz microscópica (LM) é aproximadamente de 200 nm, os recentes avanços tecnológicos usando diferentes fontes de luz, tais como a extrema ultravioleta e microscopia de raios-X suave, de forma notável aumento esta resolução para uma nm resolução quase 10 espacial 3 , 4, 5. Outros avanços tecnológicos na imagiologia incluem combinado ressonância magnética com a histologia e proporcionar um novo método para medir a espessura da bainha de mielina, in vivo, um parâmetro que foi tradicionalmente mensurável apenas no nível de microscopia electrónica (ME) 6, 7. although estes avanços no nível LM proporcionar uma excelente ferramenta para o estudo de processos de vida, uma vista de pormenor e caracterização de estruturas, tais como contactos sinápticos, só pode ser conseguido com EM, que oferece uma resolução que podem chegar a 0,5 nm. No entanto, a observação no nível EM requer que os espécimes estar morto e alterado em alguns aspectos, com fixadores químicos e processos de desidratação, a fim de preservar a citoarquitetura. Deste modo, examinando as amostras biológicas com elevada resolução pode ser difícil devido aos danos da radiação do feixe de electrões, de baixo contraste, os desvios estruturais de membranas, ou mesmo a presença de artefactos que podem ocorrer após a desidratação e epoxi incorporação 8, 9, 10.
Preservar os exemplares na sua forma nativa para análise estrutural pode ser conseguido através de "Cryo EM de secções vitrificados" ou CEMOVIS, uma abordagem que seccionamentoenvolve a congelação rápida e a incorporação da amostra em gelo vítreo e examinando as secções sob a EM, a uma temperatura criogénica 11, 12. Este procedimento permite a análise de amostras enquanto ainda estão sólida e completamente hidratado, eliminar artefactos causados por desidratação assim processa 13. No entanto, este método envolve a dispositivos adicionais para a crio-ultramicrotomia, bem como dispositivos adicionais na EM padrão, a fim de permitir que esta observação a temperaturas muito baixas, que geram custos adicionais significativos. Além disso, a abordagem CEMOVIS opõe-se à utilização de técnicas de imunomarcação, uma vez que os anticorpos normalmente têm de ser incubadas a temperatura ambiente. Em alternativa, é possível combinar a análise ultra-estrutural com os procedimentos de imuno-histoquímica utilizando uma abordagem de congelação-substituição, durante a qual as amostras fixadas com crio são lentamente descongeladas enquanto imersa em produtos químicos crio-protectora e são then incorporados em resinas especializadas, tais como Lowicryls. Pós-incorporação de imunomarcação pode então ser realizada em tal material 12. No entanto, as técnicas de substituição de congelamento e crio-fixação são demorados. Eles exigem a instalação de equipamento adicional e ainda necessitam de amostras para ser exposta ao solvente orgânico e fixador químico que pode alterar a citoarquitetura, apesar da utilização de uma baixa temperatura de 14, 15. Assim, apesar de todos os avanços tecnológicos, tanto a nível LM e EM, a fixação química do tecido do cérebro, particularmente com acroleína, continua a ser um método de baixo custo e eficiente tempo para combinar imuno-histoquímica com EM 16.
Nas últimas décadas, foram feitas muitas tentativas para encontrar uma mistura de aldeídos que fornecem a melhor preservação do tecido. Antes de 1960, o único fixador químico que deram origem a resultados aceitáveis para o EM era tetróxido de ósmio. No entanto, o tetróxido de ósmio é altamente tóxico e dispendioso, o que impede o seu uso através do sistema vascular para fixar os órgãos tais como o cérebro. Acroleína foi introduzida no final da década de 1950, como um método de confiança para a preservação do tecido animal adequado para observação EM de estruturas celulares 17. Ele penetra o tecido mais profundamente e reage mais rapidamente do que outros aldeídos quando utilizados para a fixação por imersão e permite uma boa conservação dos componentes citoplasmáticos, com encolhimento mínimo do tecido 17. Tal característica dá acroleína fixação uma clara vantagem sobre outros aldeídos quando utilizado em tecido fresco, por permitir uma localização mais exacta de vida compostos moleculares, tais como as enzimas e outras proteínas 18. Na verdade, foi validado através dos anos como um método fácil, eficiente e de baixo custo de fixação para visualização no nível de EM em muitas espécies, incluindo os anfíbios e roedores, como forma eficiente estabilizazes péptidos e proteínas, mantém a antigenicidade e fornece ultraestrutura relativamente intacto quando usado em combinação com um outro aldeído fixador 16, 18, 19, 20, 21. Os protocolos para a fixação de acroleína em roedores têm desde então sido normalizado e amplamente utilizado, particularmente pelo grupo Pickel, para implementar dupla imunomarcação para o EM 16, 22. Alguns grupos foram utilizados fixação acroleína em tecido do cérebro primata não-humano 23. No entanto, tanto quanto sabemos, só há um protocolo publicado eficientemente descrevendo fixação química com acroleína em primatas não-humanos, que é compatível com o EM imunomarcação 24.
Neste artigo, nós fornecemos um método fácil e confiável para corrigir eficientemente quimicamente não-humum cérebros de primatas com a acroleína, permitindo uma conservação potencialmente a longo prazo juntamente com pré-incorporação de imunomarcação e EM transmissão exame.
Neste artigo, é apresentado um protocolo fiável para perfusão transcardíaca de primatas não-humanos e imuno-histoquímica de pré-embebimento adequado para exame da amostra EM. Embora típico crio-EM, tais como CEMOVIS, fornece uma boa preservação da ultra-estrutura do cérebro, mas também limita a utilização de imuno-histoquímica 12. Outras técnicas, incluindo a crio-substituição e técnica Tokuyaso, permitem a incorporação de pós-imuno-histoquímica, mas estas técnicas são di…
The authors have nothing to disclose.
Este estudo foi apoiado pelas Ciências Naturais e Engenharia do Conselho de Investigação do Canadá (NSERC, 401848-2011 para MP). MP recebeu uma concessão carreira do Fonds de recherche du Quebec-Santé (FRQ-S). LE era o receptor de uma bolsa de doutoramento dos FRQ-S (FRQ-S 14D 29441). Agradecemos Marie-Josée Wallman para assistência técnica.
Dibasic anhydrous sodium phosphate (Na2HPO4) | Fisher scientific | S374-500 | |
Monobasic monohydrate sodium phosphate (NaH2PO4.H2O) | EM Science | SX0710-1 | |
Sodium chloride (NaCl) | Fisher scientific | S271-3 | |
Hydroxymethyl aminomethane (THAM) | Fisher scientific | T370-500 | |
HCl | EMD | HX0603-3 | 1N dilution. Product is corrosive. Use with appropriate potection. |
NaOH | EMD | SX0590-1 | 5N dilution. Product is corrosive. Use with appropriate protection. |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | 4% dilution. Product is highly volatile in its powder form and highly toxic. Use with caution under a venting hood with appropriate protection. |
Acrolein (90%) | sigma | 110221 | 3% dilution. Product is highly toxic. Use under a venting hood with appropriate protection. |
Autopsy venting table | Mopec | CE400 | |
Electronic perfusion pump | cole parmer | masterflex L/S 7523-90 | |
Needle (perfusion) | terumo | NN-1838R | 18G 1 1/2 |
Needle | terumo | NN-2713R | 21G 1/2 |
Ketamine | 20 mg/kg | ||
Xylazine | 4 mg/kg | ||
Acepromazine | 0.5 mg/kg | ||
Scalpel | |||
Scalpel blades | Feather lance | 201011 J9913 | No.22 for surgery and No. 11 for EM |
Surgical scissors | |||
Rongeurs | |||
Vibratome | Leica | VT 1200S | Calibrate blade before each use, when the device allows it |
Vibratome razor blade | Gillette | GIN 642107 | |
Glycerol | Fisher scientific | G33-4 | 30% dilution |
Ethylene glycol | Fisher scientific | E178-4 | 30% dilution |
Sodium borohydride (NaBH4) | sigma | S-9125 | |
Normal horse serum | Jackson immunoResearch Laboratories | 008-000-121 | 2% dilution |
Cold-fish gelatin | Aurion | 900.033 | 0.5% dilution. Original product is concentrated at 40% |
Primary antibody, SERT | Santa Cruz biotechnology | SC-1458 | 1/500 dilution |
Primary antibody, ChAT | Chemicon (Millipore) | AB144P | 1/25 dilution |
Primary antibody, TH | ImmunoStar | 22941 | 1/1000 dilution |
Biotinylated secondary antibody, goat | Vector laboratories | BA-9500 | 1/1000 dilution |
Biotinylated secondary antibody, mouse | Vector laboratories | BA-2000 | 1/1000 dilution |
Vectastain elite ABC kit | Vector laboratories | PK6100 | 8.8 µL/mL of A and B each |
3'3 diaminobenzidine (DAB) | Sigma | D5637 | 0,05% dilution. Product is highly volatile in its powder form and toxic. Do not throw waste in the sink. |
Peroxide (H2O2) 30% | Fisher scientific | H-323 | 0,005% dilution |
Osmium tetroxide (OsO4) | Electron microscopic science | 2% 19152 4% 19150 | Original solution can be either 2% ou 4%. Keep attention to which one is used to calculate the final 1% dilution. Product is very sensitive to light. Osmium is highly toxic. Use only under a venting hood with appropriate protection. |
Durcupan water-repellent epoxy resin | sigma | A: M epoxy resin (44611) B: hardener 964 (44612) C: accelerator 960 (DY 060) (44613) D: plasticizer (44614) | Polymerize 48h at 58 °C before throwing in waste. |
Alumium cups | Electron microscopic science | 70048-01 | |
Ethanol | commercial alcohols | 1019C | Dilute in distilled water with appropriate concentration |
Propylene oxide | Electron microscopic science | 20401 | Organic solvent. Highly volatile and toxic. Use under a venting hood. |
Non-coated medium glass slides | brain research laboratories | 3875-FR | Grease surface with mineral oil |
Plastic film (Aclar embedding film) | Electron microscopic science | 50425-25 | Grease surface with mineral oil |
Ultramicrotome | Leica UC7 | EM UC7 | |
Diamond trimming tool (ultratrim) | Diatome | UT 1081 | Can use glass knife alternatively |
Ultra 45° Diatome Diamond knife | Diatome | MC13437 | equipped with a boat |
Xylenes | Fisher scientific | X5SK-4 | |
150-mesh copper grids | Electron microscopic science | G150-cu | |
grid-box | Electron microscopic science | 71138 | Can store up to 100 grids |
Sodium citrate | Anachemia | 81983 | |
Lead nitrate | sigma | L-6258 | Make a stock solution of lead citrate made of 1.33 g of lead nitrate and 1.76g of sodium citrate diluted in 42 mL of pre-boiled and cooled distilled water to which 8 mL of 1N NaOH are added after the conversion from lead nitrate to lead citrate is complete. pH should be approximately 12. Store solution in a hermetic plastic bottle and protect from light. |
Syringe | terumo | SS-05L | 5 mL |
Syringe filter | corning | 431222 | 0.2 µm |
Absorbing paper (bibulous paper) | Electron microscopic science | 70086-1 | |
Parafilm | Laboratory film | PM-999 | |
Mineral oil | Sigma | M5904 |