Quantificação do comportamento de higienização da Drosophila
Summary
Este protocolo descreve uma técnica de ensaio de higiene pessoal escalável em Drosophila que produz dados robustos e quantitativos para medir o comportamento de limpeza. O método baseia-se na comparação da diferença na acumulação de corantes nos corpos de animais não preparados versus groomed durante um período de tempo definido.
Abstract
O comportamento de limpeza de Drosophila é um programa complexo de locomotores multi-passo que requer movimento coordenado de ambas as pernas dianteiras e as patas traseiras. Aqui apresentamos um protocolo de ensaio de grooming e um novo design de câmara que é econômico e escalável para estudos de pequena ou grande escala de grooming de Drosophila . As moscas são espalhadas por todo o corpo com corante Amarelo Brilhante e tem tempo para remover o corante dos seus corpos dentro da câmara. As moscas são então depositadas em um volume definido de etanol para solubilizar o corante. A absorvância espectral relativa de amostras de colorante e etanol para animais preparados e não untados é medida e registrada. O protocolo produz dados quantitativos de acumulação de corantes para moscas individuais, que podem ser facilmente calculados em média e comparados em amostras. Isso permite que os projetos experimentais avaliem facilmente a habilidade de preparação para estudos de animais mutantes ou manipulações de circuitos. Este procedimento eficiente é versátil e escalável. Mostramos wFluxo de ork do protocolo e dados comparativos entre animais WT e animais mutantes para o Receptor de Dopamina Drosophila tipo I ( DopR ).
Introduction
Grooming em Drosophila melanogaster ( D. melanogaster ) é um comportamento inata robusto que envolve a coordenação de múltiplos programas motorizados independentes 1 . As moscas da fruta limpam seus corpos de poeira, micróbios e outros agentes patogênicos que podem inibir a função fisiológica normal, como visão e vôo, ou levam a desafios imunes significativos. Na detecção e resposta a ambos mecânico 2 e activação imunitária 3, moscas repetitivamente esfregar as pernas em conjunto ou numa região do corpo alvo até que esteja suficientemente limpo e aparência progride para uma outra parte do corpo. As moscas realizam movimentos de limpeza em episódios distintos que ocorrem em grande parte nos padrões estereotipados 1 , 4 . Uma hierarquia comportamental torna-se aparente à medida que os sinais de grooming são priorizados. Circuitos e padrões de atividade foram identificados em suporte oModelo Fa que programas de limpeza na parte superior da hierarquia ocorrem primeiro e suprime sinais paralelos de áreas do corpo que são preparadas posteriormente 5 . A maior prioridade é dada à cabeça, depois ao abdômen, às asas e finalmente ao tórax 5 .
O programa de preparação em D. melanogaster é um sistema ideal para estudar circuitos neurais, sinais moleculares moduladores e neurotransmissores. Por exemplo, o comprometimento da função de neurofibromina 6 , a perda da proteína de retardamento mental frágil X de Drosophila ( dfmr1 ) 7 e a exposição ao bisfenol A (BPA) 8 causam grooming excessivo e outros comportamentos que são análogos aos sintomas humanos discretos de neurofibromatose, X frágil Síndrome e aspectos dos distúrbios do espectro do autismo e Transtorno de hiperatividade com déficit de atenção (TDAH), respectivamente. O comportamento de higienização também pode ser habituaDiferencialmente através de cepas mutantes 2 , emprestando este programa motor a estudos de plasticidade comportamental. A amplitude dos fenômenos neurológicos que podem ser modelados pela Drosophila requer uma abordagem comparativa inovadora para medir a habilidade das moscas de se prepararem.
A ação combinada de transportadores de monoaminas vesiculares e a abundância relativa de dopamina e outras aminas biogênicas no corpo demonstraram mediar o comportamento de grooming da mosca da fruta 9 , 10 . A octopamina e a dopamina estimulam a atividade comparável de higienização na pastura traseira em moscas decapitadas, enquanto a tiramina, o precursor da octopamina, também desencadeia grooming em menor extensão 7 . Foram identificados quatro receptores de dopamina em D. melanogaster 11 , 12 , 13 , 14 </sup>. Ao usar o método de análise de grooming descrito neste protocolo, determinamos um papel para o DopR de Receptor de Dopamina da Família Tipo I ( DopR, dDA1, idiota ) no comportamento de grooming nas costas 15 .
O grooming pode ser indiretamente quantificado observando a extensão da limpeza pela qual um animal pode preparar-se completamente após o pó de todo o corpo com um tinte marcador ou pó fluorescente 5 , 16 . O restante de poeira deixada no corpo pode ser usado como marcador relativo para o comportamento geral. As moscas empoeiradas depois de terem dado tempo suficiente para o noivo podem estar manifestando um déficit específico no comportamento de preparação. À medida que as pesquisas de grooming se tornaram mais extensas, os protocolos incorporaram práticas como a decapitação para adicionar tratamentos farmacológicos aos nervos conectivos do pescoço 10 , estimulação tátil de cerdas para provocar a resposta de grooming 2 ,E gravação de vídeo de comportamento 15 . A observação direta de grooming pode ser facilmente estudada usando observação visual e gravação manual da freqüência e duração de eventos específicos de grooming 4 .
Projetamos uma câmara de preparação de quinze poços que pode ser construída com uma impressora 3D ou cortador a laser, e os projetos de planos estão disponíveis para reprodução 15 . O design usa duas placas centrais juntas com aberturas combinadas e separadas por malhas e duas placas deslizantes superiores e inferiores, das quais moscas e / ou corantes são carregadas, respectivamente. Depois de permitir o tempo de moscas espumadas para o noivo, depositamos-os em etanol para solubilizar o corante e medimos a absorvância desta solução no comprimento de onda do corante. Um leitor de placas pode ser usado para múltiplas amostras paralelas ou um espectrofotômetro de leitura única pode ser usado para amostras individuais. Este método minimiza o erro induzido pelo manuseio e alBaixa para que os ensaios de limpeza sejam executados em uma escala menor e econômica. Este método é derivado e modificado a partir dos métodos iniciados por Julie Simpson e Andrew Seeds, que usam câmaras de grooming maiores com elementos de aquecimento para manipulações de circuitos sensíveis à temperatura 5 . O protocolo a seguir mostra a quantificação de grooming de todo o corpo, bem como mostrando métodos alternativos para a quantificação da acumulação de corantes em partes individuais do corpo. Também apresentamos dados de comparação de amostras entre mutantes WT e DopR , bem como métodos para calcular um índice de desempenho simples para o comportamento de higiene pessoal.
Protocol
Representative Results
Discussion
O ensaio de preparação é relativamente simples, mas advertimos os experimentadores a prestarem atenção especial às seguintes questões. Manter uma vedação apertada apertando os parafusos nas placas superior e inferior após a introdução de moscas e corantes é essencial para resultados reprodutíveis. O corante amarelo brilhante é muito fino e as juntas soltas permitirão perdas de corante das bordas da câmara. A irregularidade no teor de corante para cada poço poderia facilmente eliminar a quantificação …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Desejamos agradecer Brian Shepherd, Tat Udomritthiruj, Aaron Willey, Ruby Froom, Elise Pitmon e Rose Hedreen por trabalhos iniciais no teste e no estabelecimento desta metodologia e projetos de câmara. Agradecemos a Kelly Tellez e Graham Buchan pela leitura e edição do manuscrito. Agradecemos Andrew Seeds e Julie Simpson por seu trabalho pioneiro e seus conselhos e apoio em sugerir o uso de Brilliant Yellow Dye (Sigma). Este trabalho é apoiado em parte pelo Mary E. Groff Surgical and Medical Research and Education Charitable Trust, Bronfman Science Center e Hellman Fellows Program.
Materials
| High-Flex Tygon PVC Clear Tubing | McMaster-Carr | 5229K54 | ID 1/8", OD 1/4", used with micropipettor tips and mesh to construct mouth aspirators |
| Micropipette tips (1ml and 200ul) | Genesee Scientific | 24-165, 24-150R | |
| Nylon Mesh Screen, 2" x 2.6" | McMaster-Carr | 9318T44 | Used to construct grooming chamber and mouth aspirators |
| Dumont #5 Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5050 | |
| Brilliant Yellow Dye | Sigma-Aldrich | 201375-25G | we recommend use of nitrile gloves while handling this product |
| Vortexer | Fisher Scientific | 12-812 | set to "touch" |
| Ethanol | Carolina Biological Supply | 86-1282 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | VWR International | 10025-726 | |
| 0.65 ml microcentrifuge tubes | VWR International | 20170-293 | tubes can be reused with successive assays |
| UV 96 well plate | Corning | 26014017 | |
| BioTek Synergy HTX Platereader | BioTek | need to download catalog to access product number | http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview |
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | BioTek | ||
| Microsoft Excel | Microsoft | https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI..ql4M2LoZBEhcBljvIA)() | |
| Drosophila Incubator | Tritech | DT2-CIRC-TK | |
| 1/4" acrylic plastic | McMaster-Carr | 8473K341 | |
| 8-32 nuts | McMaster-Carr | 90257A009 | |
| 8-32 x 1" hex cap screws | McMaster-Carr | 92185A199 | the bottom plate needs to be tapped for this size screw |
| 8-32 x 1/2" hex cap screws | McMaster-Carr | 92185A194 | the second plate from the top needs to be tapped |
| 2-56 3/8" flat head phillips machine screws | McMaster-Carr | 91500A088 | these hold the two middle plates together |
| 0.175" ID, 1/4" OD, 0.34" aluminum pipe | McMaster-Carr | 92510A044 | Manufactured in-house; product listed is approximately the same dimensions and should work for size 8 screws. These act as sheaths for the 1" screws and set the hex cap up slightly from the surface of the top plate |
References
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