Dit protocol beschrijft een schaalbare individuele grooming assay techniek in Drosophila die robuuste, kwantitatieve data levert om grooming gedrag te meten. De methode is gebaseerd op het vergelijken van het verschil in ophoping van de kleurstof op de lichamen van niet-verzorgde versus geklede dieren over een bepaalde periode.
Drosophila grooming gedrag is een complex multi-step lokomotorisch programma dat gecoördineerde beweging van zowel voorbenen als achterpoten vereist. Hier presenteren we een verzorgingsprotocol en een nieuw kamerontwerp dat kostenefficiënt en schaalbaar is voor kleine of grootschalige studies van Drosophila grooming. Vliegen zijn over hun lichaam gestoffeerd met Brilliant Yellow kleurstof en geven de tijd om de kleurstof van hun lichamen in de kamer te verwijderen. Vliegen worden dan in een vast volume ethanol afgezet om de kleurstof te oplossen. De relatieve spectrale absorptie van kleurstof-ethanolmonsters voor verzorgde versus jongroomdieren wordt gemeten en opgenomen. Het protocol levert kwantitatieve gegevens van kleurstofaccumulatie voor individuele vliegen, die gemakkelijk kunnen worden vergeleken en vergeleken over monsters. Dit laat experimenteel ontwerpen toe om makkelijk te kunnen beoordelen van het rijgedrag voor mutante dierstudies of circuitmanipulaties. Deze efficiënte procedure is zowel veelzijdig als schaalbaar. Wij tonen wOrk-flow van het protocol en vergelijkende data tussen WT-dieren en mutante dieren voor de Drosophila type I Dopamine Receptor ( DopR ).
Grooming in Drosophila melanogaster ( D. melanogaster ) is een robuust aangeboren gedrag dat de coördinatie van meerdere onafhankelijke motorprogramma's omvat 1 . Fruitvliegen reinigen hun lichamen van stof, microben en andere pathogenen die de normale fysiologische functie zoals visie en vlucht kunnen belemmeren, of leiden tot significante immuunuitdagingen. Bij het detecteren en reageren op zowel mechanische 2 als immuunactivering 3 vliegen vliegen herhaaldelijk hun benen samen of op een gericht lichaamsgebied totdat het voldoende schoon is en de verzorging vordert naar een ander deel van het lichaam. Vliegen verrichten verzorgingsbewegingen in verschillende uitingen die grotendeels voorkomen in stereotype patronen 1 , 4 . Een gedragshiërarchie wordt zichtbaar aangezien de verzorgingssignalen voorrang hebben. Circuits en patronen van de activiteit zijn geïdentificeerd in ondersteuning oFa model dat verzorgingsprogramma's bovenaan de hiërarchie eerst voorkomen en parallelle signalen onderdrukken van gebieden van het lichaam dat later worden verzorgd 5 . Hoogste prioriteit wordt gegeven aan het hoofd, dan de buik, de vleugels en tenslotte de thorax 5 .
Het verzorgingsprogramma in D. melanogaster is een ideaal systeem voor het bestuderen van neurale schakelingen, modulerende moleculaire signalen en neurotransmitters. Bijvoorbeeld, compromis van neurofibromine functie 6 , verlies van Drosophila fragiel X mentale retardatieproteïne ( dfmr1 ) 7 en blootstelling aan bisfenol A (BPA) 8 veroorzaken alles overmatige verzorging en ander gedrag dat analoog is aan discrete menselijke symptomen van neurofibromatose, fragiele X Syndroom, en aspecten van autismespektrum stoornissen en respectievelijk Aandacht-Deficit Hyperactivity Disorder (ADHD). Grooming gedrag kan ook habitua zijnTed differentieel over mutante stammen 2 , lenend dit motorprogramma aan studies van gedragsplasticiteit. De breedte van neurologische verschijnselen die door Drosophila kunnen worden gemodelleerd, vraagt een nieuwe vergelijkende aanpak om de vliegen te kunnen bepalen om zelf te groomeren.
De gecombineerde werking van vesiculaire monoamine transporters en de relatieve overvloed aan dopamine en andere biogene aminen in het lichaam is aangetoond dat het vruchtenvliegverzorgingsgedrag 9 , 10 bemiddelt. Octopamine en dopamine stimuleren vergelijkbare hindleg grooming activiteit in decapitated vliegen, terwijl tyramine, de voorloper van octopamine, ook in mindere mate verzorgt 7 . Vier dopamine receptoren zijn geïdentificeerd in D. melanogaster 11 , 12 , 13 , 14 </sup>. Door gebruik te maken van de in dit protocol beschreven verzorgingsmethode, hebben we een rol vastgesteld voor de Dopamine Receptor DopR ( DopR, dDA1, dom ) van type I-familie in het achterliggende verzorgingsgedrag 15 .
Grooming kan indirect gekwantificeerd worden door te kijken naar de mate van hygiëne waarmee een dier volledig kan versieren nadat het hele lichaam met een markeringsverf of fluorescerende stof 5 , 16 is gedroogd . De rest van het stof dat op het lichaam ligt, kan als relatieve marker voor het algemene gedrag worden gebruikt. Stofvliegen na het krijgen van voldoende tijd om te bruidegom, kan een specifiek tekort in het verzorgingsgedrag manifesteren. Als verzorgingsonderzoeken uitgebreider zijn, hebben protocollen dergelijke praktijken ingebracht als decapitatie om farmacologische behandelingen op de nekbinding zenuwen toe te voegen 10 , tactiele stimulatie van borstels om de verzorgingsrespons 2 op te wekken,En video-opname van gedrag 15 . Directe waarneming van verzorging kan gemakkelijk worden bestudeerd met behulp van visuele observatie en handmatig registreren van de frequentie en de duur van specifieke verzorgingsgebeurtenissen 4 .
We hebben een vijftien goed verzorgingskamer ontworpen die met een 3D-printer of lasersnijder kan worden geconstrueerd, en de blauwdrukontwerpen zijn beschikbaar voor reproductie 15 . Het ontwerp maakt gebruik van twee gecombineerde centrale platen met openingen die zijn aangepast en gescheiden door mazen en twee extra schuif- en onderplaten, waarvan respectievelijk vliegen en / of kleurstof zijn geladen. Nadat we de stoffige vliegen tijd hebben om te verzorgen, plaatsen we ze in ethanol om de kleurstof te oplossen en de absorptie van deze oplossing te meten op de golflengte van de kleurstof. Een plaatlezer kan gebruikt worden voor meerdere parallelle monsters of een afzonderlijke-lezen spectrofotometer kan voor individuele monsters worden gebruikt. Deze methode minimaliseert de fout veroorzaakt door handelen en alLaagtepunten voor grooming assays worden uitgevoerd op een kleinere, kostenefficiënte schaal. Deze methode is afgeleid en gemodificeerd uit de methoden die door Julie Simpson en Andrew Seeds worden gepresteerd, die grotere verzorgingskamers gebruiken met verwarmingselementen voor temperatuurgevoelige circuitmanipulaties 5 . Het volgende protocol toont de kwantificering van de verzorging van het hele lichaam en toont alternatieve methoden voor het kwantificeren van kleurstofopbouw op individuele lichaamsdelen. We presenteren ook steekproefvergelijkingsgegevens tussen WT- en DopR- mutanten, evenals methoden voor het berekenen van een eenvoudige prestatie-index voor verzorgingsgedrag.
De grooming assay is relatief eenvoudig, maar we zouden waarschuwingsexperimenten speciale aandacht besteden aan de volgende problemen. Het vasthouden van een strakke afdichting door de schroeven op de boven- en onderplaten aan te trekken na het invoeren van vliegen en kleurstof is essentieel voor reproduceerbare resultaten. De briljante gele kleurstof is zeer goed en losse gewrichten zullen verliezen van kleurstof uit de randen van de kamer toestaan. De onregelmatigheid in kleurstofgehalte voor elke put kan gemakkelijk…
The authors have nothing to disclose.
Wij danken Brian Shepherd, Tat Udomritthiruj, Aaron Willey, Ruby Froom, Elise Pitmon en Rose Hedreen voor vroegtijdig werk in het testen en opzetten van deze methodologie en kamerontwerpen. We bedanken Kelly Tellez en Graham Buchan voor het lezen en bewerken van het manuscript. We danken Andrew Seeds en Julie Simpson voor hun pionierswerk en hun advies en ondersteuning bij het suggereren van het gebruik van Brilliant Yellow Dye (Sigma). Dit werk wordt gedeeltelijk ondersteund door de Mary E. Groff Chirurgische en Medische Research and Education Charitable Trust, het Bronfman Science Center en het Hellman Fellows Programma.
High-Flex Tygon PVC Clear Tubing | McMaster-Carr | 5229K54 | ID 1/8", OD 1/4", used with micropipettor tips and mesh to construct mouth aspirators |
Micropipette tips (1ml and 200ul) | Genesee Scientific | 24-165, 24-150R | |
Nylon Mesh Screen, 2" x 2.6" | McMaster-Carr | 9318T44 | Used to construct grooming chamber and mouth aspirators |
Dumont #5 Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5050 | |
Brilliant Yellow Dye | Sigma-Aldrich | 201375-25G | we recommend use of nitrile gloves while handling this product |
Vortexer | Fisher Scientific | 12-812 | set to "touch" |
Ethanol | Carolina Biological Supply | 86-1282 | |
1.5 ml microcentrifuge tubes | VWR International | 10025-726 | |
0.65 ml microcentrifuge tubes | VWR International | 20170-293 | tubes can be reused with successive assays |
UV 96 well plate | Corning | 26014017 | |
BioTek Synergy HTX Platereader | BioTek | need to download catalog to access product number | http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview |
Gen5 Microplate Reader and Imager Software | BioTek | ||
Microsoft Excel | Microsoft | https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI..ql4M2LoZBEhcBljvIA)() | |
Drosophila Incubator | Tritech | DT2-CIRC-TK | |
1/4" acrylic plastic | McMaster-Carr | 8473K341 | |
8-32 nuts | McMaster-Carr | 90257A009 | |
8-32 x 1" hex cap screws | McMaster-Carr | 92185A199 | the bottom plate needs to be tapped for this size screw |
8-32 x 1/2" hex cap screws | McMaster-Carr | 92185A194 | the second plate from the top needs to be tapped |
2-56 3/8" flat head phillips machine screws | McMaster-Carr | 91500A088 | these hold the two middle plates together |
0.175" ID, 1/4" OD, 0.34" aluminum pipe | McMaster-Carr | 92510A044 | Manufactured in-house; product listed is approximately the same dimensions and should work for size 8 screws. These act as sheaths for the 1" screws and set the hex cap up slightly from the surface of the top plate |