Summary

A Fluorescência baseada em Linfócitos ensaio adequado para high-throughput screening de pequenas moléculas

Published: March 10, 2017
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Summary

Apresenta-se no presente estudo, um ensaio baseado em fluorescência de novo utilizando linfócitos derivados de um ratinho transgénico. Este ensaio é adequado para rastreio de alto rendimento (HTS) de pequenas moléculas dotadas com a capacidade de qualquer inibição ou promoção da activação dos linfócitos.

Abstract

rastreio de alto rendimento (HTS) está actualmente a base para a identificação de entidades químicas capazes de modular as reacções bioquímicas ou processos celulares. Com o avanço das biotecnologias e o elevado potencial translacional de moléculas pequenas, uma série de abordagens inovadoras na descoberta de medicamentos têm evoluído, o que explica o interesse ressurgente no uso de HTS. O campo de oncologia é atualmente a área de pesquisa mais ativa para a triagem de drogas, sem grande avanço feito para a identificação de novos compostos imunomoduladores segmentação complicações relacionadas ao transplante ou doenças auto-imunes. Aqui, nós apresentamos um romance no ensaio linfócito fluorescente à base de murino in vitro facilmente adaptado para a identificação de novos compostos imunomoduladores. Este ensaio utiliza células T ou B derivados de um ratinho transgénico, em que o promotor conduz a expressão da GFP Nur77 mediante T ou a estimulação do receptor de células-B. À medida que a intensidade de GFP reflecte oactivação / actividade de transcrição da célula-alvo, o nosso ensaio define uma nova ferramenta para estudar o efeito de um dado composto (s) em respostas celulares / biológicas. Por exemplo, um rastreio primário foi realizado usando 4.398 compostos, na ausência de uma "hipótese de alvo", o que conduziu à identificação de potenciais sucessos 160 que exibem actividades imunomoduladoras. Assim, a utilização deste ensaio é adequado para programas de descoberta de drogas que exploram grandes bibliotecas químicas antes de serem in vitro / in vivo, os estudos de validação.

Introduction

High Throughput Screening (HTS) é uma estratégia comprovada amplamente adoptada para a identificação de novas moléculas terapêuticas ou para o reposicionamento de drogas aprovadas pela FDA em novas indicações médicas. 1 Até agora, o sucesso conseguido HTS pode ser medido pela pletora de drogas anteriormente descobertos. Por exemplo, a lapatinib inibidor de tirosina cinase utilizado para o tratamento de cancro da mama, sitagliptina; uma dipeptidil-peptidase-4 (DPP-4) inibidor utilizado como uma droga anti-hiperglicémicos, e o dasatinib inibidor de tirosina quinase Bcr-Abl oral utilizado para o tratamento de leucemia mielóide crónica representam alguns exemplos de uma longa lista de drogas aprovadas originalmente descobertas pela HTS. 2 Embora a produtividade da indústria farmacêutica ultimamente tem sofrido com a falta na descoberta de novas entidades químicas, a probabilidade de sucesso da descoberta de drogas podem ser melhorados através de um aumento no número de Candida pré-clínicates que apresentam propriedades biológicas / bioquímicas moduladores. Por conseguinte, o desenvolvimento de novos ensaios HTS adaptados para o rastreio fenotípica pode oferecer o potencial para proporcionar ferramentas farmacológicas importantes para a descoberta de novas drogas visitas. 3, 4, 5, 6 Além disso, HTS agora podem ser realizadas em um ritmo mais rápido devido às transformações tecnológicas significativas nos últimos anos, incluindo instalações de design personalizado flexíveis de robótica, novas tecnologias de leitura e do extenso miniaturização. 2, 7 Entre os fatores que contribuem para o crescente interesse no uso de triagem fenotípica (aka frente farmacologia) é a percepção de que o foco em efeitos funcionais, em vez de pressupostos reducionistas simplistas sobre alvos moleculares (/ reações bioquímicas de triagem por objectivo) é mais provável ao sho W eficácia clínica. Assim, a seleção fenotípica mantém a promessa de descobrir novos compostos potencialmente terapêuticos e vias moleculares de doenças atualmente incuráveis. 2

Para identificar correctamente inibidores ou activadores para um determinado alvo molecular ou função celular, um ensaio altamente sensível e fiável é necessária, a fim de diferenciar entre visitas de bona fide e falsos positivos. Então, o que faz um bom ensaio? A qualidade de um dado ensaio deve ser primeiro julgado por a relação sinal-ruído (reflectida por meio de um factor de Z). 8 Em segundo lugar, o efeito alvejado ou a meta da tela deve ser claramente estabelecida. Por exemplo, as abordagens baseadas em células funcionais podem oferecer vantagens significativas para o rastreio do receptor, em oposição a um ensaio especificamente concebido para avaliar o ligando-receptor de ligação. A razão para isto é que a última abordagem não é possível diferenciar entre ligandos agonistas e antagonistas.SS = "refex"> 9 Em contraste, uma abordagem baseada na célula é provável que seja mais eficaz como função do receptor pode ser avaliada directamente num fenótipo biológico (proliferação, a paragem do ciclo celular, apoptose, e / ou diferenciação). No entanto, deve notar-se que os ensaios bioquímicos pode proporcionar vantagens significativas sobre ensaios fenotípicos como eles infringir um alvo intracelular específico. Um ensaio bioquímico bem otimizado geralmente têm menos dispersão de dados do que uma triagem fenotípica, simplificando posteriormente investigações relacionadas com o mecanismo molecular de drogas de ação. No entanto, o grande inconveniente de ensaios baseados em alvo ou bioquímicos, é a possibilidade de amplificar a taxa de visitas de falsos positivos que possam afectar alvos não-específicas, quando testado num sistema biológico (perda da especificidade originalmente estudada no ensaio bioquímico). 10 Apesar de um ponto de corte bem estabelecida entre hits negativos e positivos podem minimizar o número de falsos positivos in a despistagem primária, a utilização de um sistema fisiologicamente relevante imitando o ambiente celular nativo, tais como células intactas, tecido ou animal inteiro todo permanece o núcleo do pêndulo desenhos de ensaios. Portanto, a seleção fenotípica permite a descoberta liderança com efeitos fenotípicos biológicas / desejáveis ​​para doenças sem drogas metas identificados sem ter conhecimento prévio da actividade do composto ou modo de ação. 11

O presente estudo refere-se ao desenvolvimento e teste de uma seleção fenotípica optimizada e reprodutível com base em dois componentes importantes: um modelo de rato disponível no mercado e uma sub-família agrupado de compostos químicos. No que diz respeito ao modelo animal, o ensaio baseia-se na utilização de linfócitos derivados de uma estirpe de ratinho (Nur77 GFP) que alberga um cromossoma artificial bacteriano que contém uma cassete em que a expressão da proteína fluorescente verde (GFP) é accionado por Thpromotor e Nur77. 12 A principal característica de esta estimulação é baseado no facto de que Nur77 é um gene precoce imediato sobre-regulada na sequência do receptor de células T (TCR) ou a estimulação do receptor de células B (BCR). 12 Como para o próprio método de rastreio, uma abordagem foi utilizada para ajudar a evitar o rastreio de análogos de triviais, minimizando o tempo necessário para avaliar uma biblioteca de química (> 10 5 compostos). Para isso, um banco de dados de compostos químicos selecionados por medicamentos químicos usando ferramentas Virtual foi explorada para identificar compostos topologicamente semelhantes usando estruturas de sementes ativos conhecidos como referências. Esta abordagem permitiu-nos para a tela 4.398 compostos representam uma biblioteca global de mais de 136.000 entidades químicas.

Protocol

Todos os protocolos animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados Animais da Universidade de Montreal. Os ratinhos foram sujeitos a eutanásia por inalação de CO 2 gradual até que não há sinais vitais foram observadas seguido por deslocamento cervical. O procedimento foi realizado por uma pessoa certificada para garantir que os animais foram sacrificados de forma humana e de acordo com as recomendações do Canadian Council on Animal Care. 1. Preparação de esplenócitos de…

Representative Results

Projeto do ensaio HTS Dois fatores importantes foram tomadas em consideração na concepção do ensaio aqui fluorescente. Em primeiro lugar, o que for necessário para replicar uma condição fisiológica em que a activação das células T ou B representaria uma doença (por exemplo, doença enxerto-versus-hospedeiro). Em segundo lugar, a avaliação da activação celular deve ser efectuada utilizando um método sens?…

Discussion

Vários métodos read-out foram explorada para o desenvolvimento de ensaios de HTS sensíveis e fiáveis. Estes incluem colorimétrico, luminescentes ou fluorescentes métodos. Embora os métodos colorimétricos são simples de set-up, eles exigem várias adições de produtos químicos, que podem interferir ou perturbar as células que está sendo testado. 23 Além disso, eles não permitem a avaliação dinâmica de uma resposta biológica como o efeito farmacológico é considerada como sendo …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelos fundos Merck Frosst arranque proporcionado pela Université de Montréal. Nós gostaríamos de agradecer Drs Jean Duchaine e Dominic Salois a partir da plataforma de alta capacidade no Instituto de Investigação em Imunologia e Cancro para sua discussão, comentários e feedbacks. Moutih Rafei detém uma Fonds Recherche en Santé du Québec Award de la júnior 1.

Materials

Nur77GFP mice The Jackson Laboratory Mouse strain No. 016617 An in house colony was established at our animal facility 
96 wells-U culture plates, sterile VWR International 10062-902 T-cell activation using the magnetic beads
70µm cell strainer, sterile Corning Inc. 352350 Generation of splenocytes cell suspension
5 ml polystyrene round bottom tubes, sterile Corning Inc. 352058 Generation of splenocytes cell suspension
50 ml polypropylene conical bottom tubes, sterile VWR International 89039-656  Generation of splenocytes cell suspension
10 ml syringe without needle, sterile Becton, Dickinson and Company 305482 To mash the spleen
T-25 culture flask Greiner Bio-One 690 175 To incudabte B cells during activation
5 ml cell culture dish, sterile Greiner Bio-One 627 160 To mash the spleen
Penicillin- Streptomycin (10,000 U/mL) WISENT Inc. 450-200-EL   Component of the splenocyte media
RPMI 1600 with sodium bicarbonate and L- glutamine WISENT Inc. 350-002-CL  Component of the splenocyte media
MEM non-essential amino acids WISENT Inc. 321-010-EL  Component of the splenocyte media
HEPES free acid 1 M WISENT Inc. 330-050-EL  Component of the splenocyte media
Sodium pyruvate solution (100mM) WISENT Inc. 600-110-EL  Component of the splenocyte media
Fetal Bovine Serum (FBS)  WISENT Inc. 080-910  Component of the splenocyte media and flow-cytometry buffer
Phosphate buffered saline (PBS) WISENT Inc. 311-010-CL Component of flow-cytometry buffer
2-Mercaptoethanol (55mM) Thermo Fisher Scientific 21985-023 Component of the splenocyte media
T- Cells isolation kit Stemcell Technologies 19851 To isolate T cells
B- Cells isolation kit Stemcell Technologies 19854 To isolate B cells
Mouse T-Activator CD3/CD28 superparamagnetic beads Thermo Fisher Scientific 11452D To activate T cells 
Cell isolation magnet Stemcell Technologies 18000 To isolate T cells and remove the magnetic beads 
AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG + IgM (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 115-006-068 To stimulate B cells
Recombinant Murine IL-7 Peprotech 217-17  To support T-cell survival during activation
Recombinant CD40L R&D Systems 8230-CL/CF To stimulate B cells
Anti-mouse CD3 antibody BD Pharmingen 561799 To stain T cells for flow-cytometry
Anti-mouse CD19 antibody BD Pharmingen 553786 To stain B cells for flow-cytometry
Biomed FXp PerkinElmer Inc. A31842 To re-suspend cells after 24 hours incubation
Opera Phenix High Content Screening System PerkinElmer Inc. HH14000000 To analyze GFP/Hoechst signal

References

  1. Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nat Rev Drug Discov. 10 (7), 507-519 (2011).
  2. Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 188-195 (2011).
  3. Lokey, R. S. Forward chemical genetics: progress and obstacles on the path to a new pharmacopoeia. Curr Opin Chem Biol. 7 (1), 91-96 (2003).
  4. Hall, S. E. Chemoproteomics-driven drug discovery: addressing high attrition rates. Drug Discov Today. 11 (11-12), 495-502 (2006).
  5. Pruss, R. M. Phenotypic screening strategies for neurodegenerative diseases: a pathway to discover novel drug candidates and potential disease targets or mechanisms. CNS Neurol Disord Drug Targets. 9 (6), 693-700 (2010).
  6. St Onge, R., Schlecht, U., Scharfe, C., Evangelista, M. Forward chemical genetics in yeast for discovery of chemical probes targeting metabolism. Molecules. 17 (11), 13098-13115 (2012).
  7. Houston, J. G., Banks, M. N., Binnie, A., Brenner, S., O’Connell, J., Petrillo, E. W. Case study: impact of technology investment on lead discovery at Bristol-Myers Squibb. Drug Discov Today. 13 (1-2), 44-51 (2008).
  8. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  9. Walters, W. P., Namchuk, M. Designing screens: how to make your hits a hit. Nat Rev Drug Discov. 2 (4), 259-266 (2003).
  10. Zheng, W., Thorne, N., McKew, J. C. Phenotypic screens as a renewed approach for drug discovery. Drug Discov Today. 18 (21-22), 1067-1073 (2013).
  11. Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. Statistical practice in high-throughput screening data analysis. Nat Biotechnol. 24 (2), 167-175 (2006).
  12. Moran, A. E., et al. T cell receptor signal strength in Treg and iNKT cell development demonstrated by a novel fluorescent reporter mouse. J Exp Med. 208 (6), 1279-1289 (2011).
  13. Kovacic, N., Müthing, J., Marusic, A. Immunohistological and Flow Cytometric Analysis of Glycosphingolipid Expression in Mouse Lymphoid Tissues. J Histochem Cytochem. 48, 1677-1689 (2000).
  14. Shapiro, H. M. Flow cytometric estimation of DNA and RNA content in intact cells stained with hoechst 33342 and pyronin Y. Cytometry. 2, 143-150 (1981).
  15. Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends Biotechnol. 28 (5), 237-245 (2010).
  16. An, W. F. Fluorescence-based assays. Methods Mol Biol. 486, 97-107 (2009).
  17. Kishimoto, H., Sprent, J. Strong TCR ligation without costimulation causes rapid onset of Fas-dependent apoptosis of naive murine CD4+ T cells. J Immunol. 163 (4), 1817-1826 (1999).
  18. Schluns, K. S., Kieper, W. C., Jameson, S. C., Lefrancois, L. Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo. Nat Immunol. 1 (5), 426-432 (2000).
  19. Jiang, Q., et al. Cell biology of IL-7, a key lymphotrophin. Cytokine Growth Factor Rev. 16 (4-5), 513-533 (2005).
  20. Koenen, P., et al. Mutually exclusive regulation of T cell survival by IL-7R and antigen receptor-induced signals. Nat Commun. 4, 1735 (2013).
  21. Vella, A., Teague, T. K., Ihle, J., Kappler, J., Marrack, P. Interleukin 4 (IL-4) or IL-7 prevents the death of resting T cells: stat6 is probably not required for the effect of IL-4. J Exp Med. 186 (2), 325-330 (1997).
  22. Hawkins, C. J., Vaux, D. L. The role of the Bcl-2 family of apoptosis regulatory proteins in the immune system. Semin Immunol. 9 (1), 25-33 (1997).
  23. Sumantran, V. N. Cellular chemosensitivity assays: an overview. Methods Mol Biol. 731, 219-236 (2011).
  24. Huh, S., et al. A cell-based system for screening hair growth-promoting agents. Arch Dermatol Res. 301 (5), 381-385 (2009).
  25. Weiss, A. TCR signal transduction: opening the black box. J Immunol. 183 (8), 4821-4827 (2009).
  26. Noel, P. J., Boise, L. H., Green, J. M., Thompson, C. B. CD28 costimulation prevents cell death during primary T cell activation. J Immunol. 157 (2), 636-642 (1996).
  27. Michels, A. W., et al. Structure-based selection of small molecules to alter allele-specific MHC class II antigen presentation. J Immunol. 187 (11), 5921-5930 (2011).

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Cite This Article
Fouda, A., Tahsini, M., Khodayarian, F., Al-nafisah, F., Rafei, M. A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules. J. Vis. Exp. (121), e55199, doi:10.3791/55199 (2017).

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