Summary

Ein Fluoreszenz-basierte Lymphocyte Assay geeignet für Hochdurchsatz-Screening von kleinen Molekülen

Published: March 10, 2017
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Summary

Wir präsentieren in der aktuellen Studie eine neuartige fluoreszenzbasierten Assays von einer transgenen Maus abgeleiteten Lymphozyten. Dieser Assay ist für Hochdurchsatz-Screening (HTS) von kleinen Molekülen dotiert mit einer Kapazität von entweder Hemmung oder Förderung der Lymphozytenaktivierung geeignet.

Abstract

High-Throughput-Screening (HTS) ist derzeit die Hauptstütze für die Identifizierung chemischer Einheiten fähig biochemischer Reaktionen oder zellulärer Prozesse zu modulieren. Mit der Weiterentwicklung der Biotechnologien und der hohen translationale Potenzial von kleinen Molekülen, eine Reihe von innovativen Ansätzen in der Wirkstoffforschung entwickelt haben, die den wieder auflebenden Interesse an der Verwendung von HTS erklärt. Die Onkologie Bereich ist derzeit der aktivste Forschungsgebiet für Wirkstoff-Screening, ohne großen Durchbruch für die Identifizierung neuer immunmodulatorischer Verbindungen Targeting Transplantation Komplikationen im Zusammenhang mit oder Autoimmunerkrankungen gemacht. Hier stellen wir ein neues in vitro murine fluoreszenzbasierten Lymphozyten – Assay zur Identifizierung neuer immunmodulatorischen Verbindungen leicht angepasst. Dieser Assay verwendet T- oder B-Zellen von einer transgenen Maus abgeleitet ist, in dem der Promotor Nur77 GFP-Expression auf T- oder B-Zellen-Rezeptor-Stimulation steuert. Da die GFP Intensität spiegelt dieAktivierung / transkriptionale Aktivität der Zielzelle, unser Test definiert einen neuen Werkzeug, um die Wirkung der gegebenen Verbindung (en) auf die zelluläre / biologische Reaktionen zu untersuchen. Verwendung von 4.398 Verbindungen in Abwesenheit eines "Zielhypothese" wurde zum Beispiel ein primäres Screening durchgeführt, die auf die Identifizierung von 160 potentiellen Treffer anzeigt immunmodulatorischen Aktivitäten führte. Somit ist die Verwendung dieses Assays für die Wirkstoffforschung Programme Erforschung großer chemischer Bibliotheken vor geeignet , um in vitro / invivo – Validierungsstudien fördern.

Introduction

Hochdurchsatz-Screening (HTS) ist eine bewährte Strategie weithin für die Identifizierung neuer therapeutischer Moleküle oder für die Neupositionierung von FDA-zugelassenen Medikamente in neuen medizinischen Indikationen angenommen. 1 Bisher kann die erzielte HTS Erfolg durch die Fülle der bisher entdeckten Drogen gemessen werden. Zum Beispiel verwendet der Tyrosinkinaseinhibitor lapatinib für die Behandlung von Brustkrebs, sitagliptin; ein Dipeptidyl-Peptidase-4 (DPP-4) Inhibitors als antihyperglykämischen Medikament, und die orale Bcr-Abl-Tyrosinkinase-Inhibitor dasatinib für die Behandlung von chronischer myeloischer Leukämie stellen einige Beispiele für eine lange Liste von zugelassenen Medikamente ursprünglich entdeckt, verwendet durch HTS. 2 Obwohl die Produktivität der pharmazeutischen Industrie in letzter Zeit von einem Mangel in der Entdeckung neuer chemischer Einheiten erlitten hat, kann die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Wirkstoffforschung durch eine Erhöhung der Anzahl der vorklinischen Candida verbessert werdentes Anzeige modulierende biologische / biochemische Eigenschaften. Dementsprechend könnte die Entwicklung von neuen HTS-Assays zur phänotypischen Screening angepasst bieten das Potential wichtige pharmakologische Werkzeuge zur Entdeckung neuer Medikamente Treffern zu liefern. 3, 4, 5, 6 Darüber hinaus HTS kann nun in einem schnelleren Tempo durchgeführt werden aufgrund erheblichen technologischen Veränderungen in den letzten Jahren mit speziell entwickelten flexiblen Roboterinstallationen, neue Auslesetechnologien und umfassende Miniaturisierung. 2, 7 Unter den Faktoren , die zu dem wachsenden Interesse an der Verwendung von phänotypischen Screening (auch bekannt als Vorwärts-Pharmakologie) ist die Wahrnehmung beitragen , dass eher als vereinfachend reduktionistischen Annahmen über funktionale Effekte konzentriert in Bezug auf molekulare Targets (Zielbasierte Screening / biochemische Reaktionen) wahrscheinlicher ist , zu sho w klinische Wirksamkeit. Somit hält phänotypischen Screening versprechen neue potentiell therapeutischen Verbindungen und molekularen Mechanismen von derzeit unheilbar Krankheiten aufzudecken. 2

Um richtig Inhibitoren oder Aktivatoren für eine gegebene molekulare Ziel oder die Zellfunktion zu identifizieren, ein hoch empfindlicher und zuverlässiger Assay erforderlich ist, um zwischen bona fide – Hits und Fehlalarme zu unterscheiden. Also, was macht einen guten Test? Die Qualität eines gegebenen Assay müssen zunächst durch das Signal-zu-Rausch-Verhältnis beurteilt werden (durch einen Z-Faktor reflektiert). 8 Zweitens ist die gezielte Wirkung oder das Ziel des Bildschirms sollte eindeutig festgelegt. Zum Beispiel, funktionale zellbasierte Ansätze können erhebliche Vorteile für die Rezeptor-Screening bieten als die Bindung an einen Assay spezifisch zu beurteilen Ligand-Rezeptor entworfen gegenüber. Der Grund dafür ist, dass der letztgenannte Ansatz nicht zwischen Agonisten- und Antagonisten-Liganden unterscheiden.ss = "xref"> 9 Im Gegensatz dazu ist eine zellbasierte Ansatz ist wahrscheinlich (, Zellzyklusarrest, Apoptose und / oder Differenzierung Proliferation) zu sein , kann effektiver als Rezeptor – Funktion direkt in einem biologischen Phänotyp beurteilt werden. Es muss jedoch beachtet werden, daß biochemische Assays wesentliche Vorteile gegenüber phänotypischen Assays stellen können, da sie auf einem spezifischen intrazellulären Ziel verletzen. Eine gut optimierte biochemische Assays haben in der Regel weniger Datenstreuung als eine phänotypische Screening während danach Untersuchungen zum Drogen molekularen Wirkmechanismus der im Zusammenhang zu vereinfachen. Jedoch ist der Hauptnachteil der zielbasierten oder biochemischen Assays die Wahrscheinlichkeit, die Rate falsch positiver Treffer Amplifizieren die unspezifischen Targets beeinflussen können, wenn sie in einem biologischen System (Verlust der Spezifität ursprünglich untersucht in der biochemischen Assay) getestet. 10 Obwohl ein gut etabliertes Grenzpunkt zwischen negativen und positiven Treffer können die Anzahl der Fehlalarme zu minimieren in die primäre Screening, die Verwendung eines physiologisch relevanten System die nativen zellulären Umgebung wie intakte Zellen, Gewebe oder ganzen ganze Tier nachahmt bleibt der Kern des Assaydesigns Pendels. Daher ermöglicht phänotypischen Screening Leitstruktursuche mit wünschenswerten biologischen / phänotypischen Wirkungen für Krankheiten, bei denen keine Angriffspunkte für Medikamente ohne vorherige Kenntnis der Verbindung der Aktivität oder Wirkungsweise aufweist. 11

Die hierin Studie bezieht sich auf die Entwicklung und Erprobung eines optimierten und reproduzierbaren Screening phänotypische basiert auf zwei wichtigen Komponenten: eine handelsübliche Maus-Modell und einem gruppierten Unterfamilie von chemischen Verbindungen. In Bezug auf das Tiermodell beruht der Test auf der Verwendung von Lymphozyten aus einer Maus – Stamm abgeleitet (Nur77 GFP) ein bakterielles künstliches Chromosom beherbergt eine Kassette enthält , in dem die Expression des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) von th angetrieben wirde Nur77-Promotor. 12 Das Kennzeichen dieser Stimulation basiert auf der Tatsache , dass Nur77 ein immediate early Gens hochreguliert folgenden T-Zell – Rezeptor (TCR) oder B-Zell – Rezeptor (BCR) Stimulation. 12 Wie für das Screening – Verfahren selbst wurde ein Ansatz verwendet , um das Screening von trivialen Analoga zu helfen , zu vermeiden , während die Zeit eine große chemische Bibliothek zu beurteilen , zu minimieren benötigt (> 10 5 Verbindungen). Dazu wählte eine Datenbank von chemischen Verbindungen, die durch medizinischen Chemikern virtuelles Screening-Tools wurde ausgebeutet zu identifizieren topologisch ähnliche Verbindungen bekannten aktiven Samenstrukturen als Referenzen. Dieser Ansatz erlaubt uns 4398 Verbindungen Einheiten vertreten, eine Gesamt Bibliothek von über 136.000 chemischen Bildschirm.

Protocol

Alle Tier Protokolle wurden von der Animal Care Committee der Université de Montréal genehmigt. Die Mäuse wurden durch allmähliche Einatmen von CO 2 , bis keine Vital eingeschläfert wurden durch Genickbruch folgte beobachtet. Das Verfahren wurde von einem zertifizierten Person durchgeführt, um sicherzustellen, dass die Tiere auf humane Weise eingeschläfert wurden und entsprechend den Empfehlungen des Canadian Council on Animal Care. 1. Herstellung von Splenozyten-Medium und D…

Representative Results

Entwurf des HTS-Assay Zwei wichtige Faktoren wurden berücksichtigt, wenn die hierin Fluoreszenztest zu entwerfen. Zuerst mussten wir einen physiologischen Zustand zu replizieren , in der T- oder B – Zell – Aktivierung eine Krankheit (zB graft-versus-host disease) darstellen würde. Zweitens sollte die Beurteilung der zellulären Aktivierung durchgeführt werden, um eine empfindliche und quantitative Methode. Die Fluores…

Discussion

Mehrere Ausleseverfahren wurden für die Entwicklung von empfindlichen und zuverlässigen HTS-Assays genutzt werden. Dazu gehören kolorimetrischen, lumineszente oder Fluoreszenzmethoden. Obwohl farbmetrischen Methoden einfach einzurichten sind, benötigen sie mehrere Zugaben von Chemikalien, die getestet stören oder unterbrechen können wobei die Zellen. 23 Darüber hinaus sind sie erlauben keine dynamische Bewertung einer biologischen Reaktion , wie die pharmakologische Wirkung zu einem bestim…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von der Merck Frosst Startkapital zur Verfügung gestellt von der Université de Montréal unterstützt. Wir möchten Drs Jean Duchaine und Dominic Salois aus der Hochdurchsatzplattform am Institut für Forschung in der Immunologie und Krebs für ihre Diskussion, Kommentare und Feedbacks zu danken. Moutih Rafei hält einen Fonds de la Recherche en Santé du Québec Junior 1 Auszeichnung.

Materials

Nur77GFP mice The Jackson Laboratory Mouse strain No. 016617 An in house colony was established at our animal facility 
96 wells-U culture plates, sterile VWR International 10062-902 T-cell activation using the magnetic beads
70µm cell strainer, sterile Corning Inc. 352350 Generation of splenocytes cell suspension
5 ml polystyrene round bottom tubes, sterile Corning Inc. 352058 Generation of splenocytes cell suspension
50 ml polypropylene conical bottom tubes, sterile VWR International 89039-656  Generation of splenocytes cell suspension
10 ml syringe without needle, sterile Becton, Dickinson and Company 305482 To mash the spleen
T-25 culture flask Greiner Bio-One 690 175 To incudabte B cells during activation
5 ml cell culture dish, sterile Greiner Bio-One 627 160 To mash the spleen
Penicillin- Streptomycin (10,000 U/mL) WISENT Inc. 450-200-EL   Component of the splenocyte media
RPMI 1600 with sodium bicarbonate and L- glutamine WISENT Inc. 350-002-CL  Component of the splenocyte media
MEM non-essential amino acids WISENT Inc. 321-010-EL  Component of the splenocyte media
HEPES free acid 1 M WISENT Inc. 330-050-EL  Component of the splenocyte media
Sodium pyruvate solution (100mM) WISENT Inc. 600-110-EL  Component of the splenocyte media
Fetal Bovine Serum (FBS)  WISENT Inc. 080-910  Component of the splenocyte media and flow-cytometry buffer
Phosphate buffered saline (PBS) WISENT Inc. 311-010-CL Component of flow-cytometry buffer
2-Mercaptoethanol (55mM) Thermo Fisher Scientific 21985-023 Component of the splenocyte media
T- Cells isolation kit Stemcell Technologies 19851 To isolate T cells
B- Cells isolation kit Stemcell Technologies 19854 To isolate B cells
Mouse T-Activator CD3/CD28 superparamagnetic beads Thermo Fisher Scientific 11452D To activate T cells 
Cell isolation magnet Stemcell Technologies 18000 To isolate T cells and remove the magnetic beads 
AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG + IgM (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 115-006-068 To stimulate B cells
Recombinant Murine IL-7 Peprotech 217-17  To support T-cell survival during activation
Recombinant CD40L R&D Systems 8230-CL/CF To stimulate B cells
Anti-mouse CD3 antibody BD Pharmingen 561799 To stain T cells for flow-cytometry
Anti-mouse CD19 antibody BD Pharmingen 553786 To stain B cells for flow-cytometry
Biomed FXp PerkinElmer Inc. A31842 To re-suspend cells after 24 hours incubation
Opera Phenix High Content Screening System PerkinElmer Inc. HH14000000 To analyze GFP/Hoechst signal

References

  1. Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nat Rev Drug Discov. 10 (7), 507-519 (2011).
  2. Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 188-195 (2011).
  3. Lokey, R. S. Forward chemical genetics: progress and obstacles on the path to a new pharmacopoeia. Curr Opin Chem Biol. 7 (1), 91-96 (2003).
  4. Hall, S. E. Chemoproteomics-driven drug discovery: addressing high attrition rates. Drug Discov Today. 11 (11-12), 495-502 (2006).
  5. Pruss, R. M. Phenotypic screening strategies for neurodegenerative diseases: a pathway to discover novel drug candidates and potential disease targets or mechanisms. CNS Neurol Disord Drug Targets. 9 (6), 693-700 (2010).
  6. St Onge, R., Schlecht, U., Scharfe, C., Evangelista, M. Forward chemical genetics in yeast for discovery of chemical probes targeting metabolism. Molecules. 17 (11), 13098-13115 (2012).
  7. Houston, J. G., Banks, M. N., Binnie, A., Brenner, S., O’Connell, J., Petrillo, E. W. Case study: impact of technology investment on lead discovery at Bristol-Myers Squibb. Drug Discov Today. 13 (1-2), 44-51 (2008).
  8. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  9. Walters, W. P., Namchuk, M. Designing screens: how to make your hits a hit. Nat Rev Drug Discov. 2 (4), 259-266 (2003).
  10. Zheng, W., Thorne, N., McKew, J. C. Phenotypic screens as a renewed approach for drug discovery. Drug Discov Today. 18 (21-22), 1067-1073 (2013).
  11. Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. Statistical practice in high-throughput screening data analysis. Nat Biotechnol. 24 (2), 167-175 (2006).
  12. Moran, A. E., et al. T cell receptor signal strength in Treg and iNKT cell development demonstrated by a novel fluorescent reporter mouse. J Exp Med. 208 (6), 1279-1289 (2011).
  13. Kovacic, N., Müthing, J., Marusic, A. Immunohistological and Flow Cytometric Analysis of Glycosphingolipid Expression in Mouse Lymphoid Tissues. J Histochem Cytochem. 48, 1677-1689 (2000).
  14. Shapiro, H. M. Flow cytometric estimation of DNA and RNA content in intact cells stained with hoechst 33342 and pyronin Y. Cytometry. 2, 143-150 (1981).
  15. Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends Biotechnol. 28 (5), 237-245 (2010).
  16. An, W. F. Fluorescence-based assays. Methods Mol Biol. 486, 97-107 (2009).
  17. Kishimoto, H., Sprent, J. Strong TCR ligation without costimulation causes rapid onset of Fas-dependent apoptosis of naive murine CD4+ T cells. J Immunol. 163 (4), 1817-1826 (1999).
  18. Schluns, K. S., Kieper, W. C., Jameson, S. C., Lefrancois, L. Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo. Nat Immunol. 1 (5), 426-432 (2000).
  19. Jiang, Q., et al. Cell biology of IL-7, a key lymphotrophin. Cytokine Growth Factor Rev. 16 (4-5), 513-533 (2005).
  20. Koenen, P., et al. Mutually exclusive regulation of T cell survival by IL-7R and antigen receptor-induced signals. Nat Commun. 4, 1735 (2013).
  21. Vella, A., Teague, T. K., Ihle, J., Kappler, J., Marrack, P. Interleukin 4 (IL-4) or IL-7 prevents the death of resting T cells: stat6 is probably not required for the effect of IL-4. J Exp Med. 186 (2), 325-330 (1997).
  22. Hawkins, C. J., Vaux, D. L. The role of the Bcl-2 family of apoptosis regulatory proteins in the immune system. Semin Immunol. 9 (1), 25-33 (1997).
  23. Sumantran, V. N. Cellular chemosensitivity assays: an overview. Methods Mol Biol. 731, 219-236 (2011).
  24. Huh, S., et al. A cell-based system for screening hair growth-promoting agents. Arch Dermatol Res. 301 (5), 381-385 (2009).
  25. Weiss, A. TCR signal transduction: opening the black box. J Immunol. 183 (8), 4821-4827 (2009).
  26. Noel, P. J., Boise, L. H., Green, J. M., Thompson, C. B. CD28 costimulation prevents cell death during primary T cell activation. J Immunol. 157 (2), 636-642 (1996).
  27. Michels, A. W., et al. Structure-based selection of small molecules to alter allele-specific MHC class II antigen presentation. J Immunol. 187 (11), 5921-5930 (2011).

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Fouda, A., Tahsini, M., Khodayarian, F., Al-nafisah, F., Rafei, M. A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules. J. Vis. Exp. (121), e55199, doi:10.3791/55199 (2017).

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