Yetişkin Drosophila beyin nöronal devreleri, yüksek beyin fonksiyonları ve karmaşık bozuklukları çalışmak için değerli bir sistemdir. Etkin bir yöntem, beyin temelli çalışmalar kolaylaştıracak küçük sinek kafasından tüm beyin dokusu incelemek için. Burada iyi korunmuş morfolojisi ile yetişkin beyinlerinde basit, tek adımlı diseksiyon protokol açıklar.
İnsan beyni dejeneratif hastalıkların modeli yetişkin beyinlerinde nöronal devreler harita ve yüksek beyin fonksiyonlarının moleküler ve hücresel temelini incelemek için Drosophila kullanarak artan bir ilgi vardır. iyi korunmuş morfolojisi erişkin beyinlerinin bir bütün montaj hazırlığı gibi tüm beyin temelli çalışmalar için kritik, ama teknik olarak oldukça zor ve zaman alıcı olabilir. takip eden işlem aşamalarını kolaylaştırmak için vücudun geri kalan bağlı bozulmamış beyin tutarken Bu protokol, en az 10 s bir yetişkin sinek kafasının kolay öğrenmek için, tek-aşamalı bir diseksiyon yaklaşımı tarif eder. prosedür normalde daha sonra görüntüleme adımla engelleyebilir beyin ile ilişkili göz ve trakea dokuların en temizlenmesine yardımcı olur ve aynı zamanda diseksiyon forseps kalitesine daha az talep yerleştirir. Buna ek olarak, B her iki tarafına görüntüleme için önemli olan bir lamel üzerine monte edilmiş, beyin örnekleri uygun bir çevirme sağlayan basit bir yöntem tarifbenzer sinyal yoğunluğu ve kalitesi ile yağmurlar. Protokolün bir örneği olarak, biz WT yetişkin beyinlerinde dopaminerjik (DA) nöronların ilişkin bir analizi sunması (1118 w) uçar. Diseksiyon yöntemi yüksek etkinlik Drosophila büyük ölçekli yetişkin beyin temelli çalışmalar için özellikle yararlı hale getirir.
Yaygın meyve sineği olarak bilinen model organizma Drosophila, uzun zarif genetik araçlar, kısa üreme kez değerlemeye tabi tutulmuştur ve son derece moleküler ve hücresel yollar korunmuş bulunmaktadır. Meyve sineği başarıyla temel sinyal yollarını, çok hücreli organizmaların desenlendirme mekanizmaları yanı sıra nöronal gelişimi, işlevleri altında yatan mekanizmaları ve hastalıkları 1,2 teşrih istihdam edilmiştir. Hücre etiketleme ve görüntüleme teknolojilerindeki son gelişmelerle birlikte, meyve sineği beyin, nöronal devrenin ince haritalama ve öğrenme ve hafıza ve sirkadiyen ritim 1,3 gibi yüksek beyin fonksiyonları, moleküler ve hücresel temelini diseksiyon özellikle güçlü hale geldi 4,5,6,7,8.
Drosophila sisteminin bir avantajı normal bir bileşik veya konfokal mikroskop kullanılarak beyin tüm montaj hazırlanması ve incelenmesini sağlayan nispeten küçük bir boyutudur. This özelliği dolayısıyla bütünün içinde bir çalışılan konu bütüncül bakış ve onun tam geometri hem sağlayarak, tüm beyin dokusunda bağlamında, hücresel ve hücre içi düzeyde nöronal devrenin detaylı anatomik ve fonksiyonel analiz, hatta tek bir nöronu mümkün kılar beyin. Ancak, beynin oldukça minyatür boyutu göz önüne alındığında, aynı zamanda verimli bir yetişkin sinek koruyucu dış iskelet kafa davanın dışında sağlam bir beyin dokusunu diseksiyon teknik bir meydan okuma sunuyor. Çeşitli etkili ve nispeten basit diseksiyon yöntemleri genellikle dikkatli içerir ve adım adım kafa durumda kaldırılmasını ve gözler dahil ilişkili dokuları, trakea ve yağ 9, 10. Bunlar mikrocerrahi diseksiyon yöntemlerinin doğru beyin, hangi detaylı bir şekilde tarif edilmiştir genellikle kolayca zarar görebilir ince iyi hizalanmış ipuçları forseps dayanarak, diseksiyon forseps kalitesi oldukça sıkı talepleri yerleştirin. Dahası, disseke beyinler genellikle separat vardırvücudun geri kalan ed, beyinleri nedeniyle kolayca, küçük boyutları ve işlem tampon maddesi içinde şeffaflığının daha sonra boyanması ve yıkama işlemleri sırasında kaybolabilir. Burada, gövde bağlı disseke beyinleri tutan yetişkin beyinlerinde için, nispeten basit ve kolay öğrenilebilen bir adım diseksiyon protokol açıklar. Diseksiyon işlemi genellikle kolay gibi göz ve trakea gibi beyin ilişkili dokuların en uzak temizler ve kaliteli diseksiyonu forseps ihtiyacını azaltır.
floresan bileşik mikroskop veya konfokal mikroskop altında beyin görüntüleme, ayrıca, uzak floresan ışık kaynağından beynin yan nedeniyle genellikle tüm montaj beyin kalınlığı zayıf bir sinyal ve daha az net görüntüler üretir. Burada, biz de benzer sinyal intensi ile beynin her iki tarafın uygun görüntüleme sağlayan, beyin numunelerinin kolay saygısız sağlayan basit bir montaj yöntemi açıklarty ve kalite.
Bir kanıtı-of-concept yetişkin beyin incelemek için bu yöntemin uygulanması için, biz daha 1118 sinekler w beyinlerinde DA nöronların varlığını incelendiğinde; genellikle transgenik sinekler ve birçok Drosophila çalışmalarında vahşi tipli denetimi oluşturmak için ebeveyn hattı olarak kullanılan bir genotip.
İnsan beyni hastalıkları, nöronal devreleri, ve yüksek beyin fonksiyonlarını incelemek için yetişkin Drosophila beyin kullanarak artan bir ilgi ile, orta serili için özellikle önemlidir tam montaj analizleri, bozulmadan sinek beyinleri elde etmek basit ve hızlı yöntemler geliştirilmesi gerekmektedir beyin temelli ekranlar ölçek. Bizim yöntem basit ve kolay öğrenirler bir sinek kafası dışarı incelemek için bir yaklaşım (genellikle tecrübesi ile en az 10 s) iyi korunmuş morfolojisi i…
The authors have nothing to disclose.
Biz projeye büyük destek Sayın Enes Mehmet, Bayan Kiara Andrade, Bayan Pilar Rodriguez, Chris Kwok ve Bayan Danna Mü'min kabul.
w*; parkΔ21/TM3, P{GAL4-Kr.C}DC2, P{UAS-GFP.S65T}DC10, Sb1 | Bloomington Drosophila Stock Center | 51652 | Balancer was switched to TM6B |
PBac{WH}parkf01950 | Exelixis at Harvard Medical School | f01950 | Balancer was switched to TM6C |
NaCl | Fisher Scientific | S640-500 | |
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific | 02-003-990 | |
Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366-500 | |
Sodium phosphate, monobasic monohydrate (NaHCO3) | Fisher Scientific | 02-004-198 | |
Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | 02-003-265 | |
D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-500G | Replaces glucose |
Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
EMD Millipore Durapore PVDF Membrane Filters: Hydrophilic: 0.22µ Pore Size | Fisher Scientific | GVWP14250 | |
Formalin Solution, 10% (Histological) | Fisher Scientific | SF98-20 | |
Potassium Phosphate, Dibasic, Powder, Ultrapure Bioreagent | Fisher Scientific | 02-003-823 | |
Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
Excelta Precision Tweezers with Very Fine Points | Fisher Scientific | 17-456-055 | Protocol does not require very fine points. |
Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody | Pel-Freez Biologicals | P40101 | |
Rat-Elav-7E8A10 anti-elav | The Developmental Studies Hybridoma Bank | Clone 7E8A10 | |
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-21247 | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-11037 | |
DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
Propyl gallate powder | Sigma-Aldrich | P3130-100G | |
Glycerol ACS reagent, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | G7893-500ML | |
Zeiss Axioimager Z1 | Zeiss | Quote | |
Zeiss Apotome.2 | Zeiss | Quote | |
Zen lite software | Quote |