De volwassen Drosophila hersenen waardevol voor de studie van neuronale circuits, hogere hersenfuncties, en complexe aandoeningen. Een efficiënte methode om hele hersenweefsel van de kleine vlieg hoofd ontleden zal brain-based studies vergemakkelijken. Hier beschrijven we een eenvoudige, een-stap dissectie protocol van volwassen hersenen met goed bewaard gebleven morfologie.
Er is een toenemende belangstelling voor het gebruik Drosophila tot menselijke hersenen degeneratieve ziekten te modelleren, kaart neuronale circuits in volwassen hersenen, en de studie van de moleculaire en cellulaire basis van de hogere hersenfuncties. Een hele-mount voorbereiding van de volwassen hersenen met goed bewaarde morfologie is van cruciaal belang voor een dergelijke hersenen als geheel op basis van studies, maar kan technisch uitdagende en tijdrovend zijn. Dit protocol beschrijft een eenvoudig te leren, een stap dissectie aanpak van een volwassen vliegen kop in minder dan 10 s, terwijl de intacte hersenen aan de rest van het lichaam om verdere verwerkingsstappen vergemakkelijkt. De procedure helpt bij het verwijderen van de meeste oog en tracheale weefsels die normaal zijn voor de hersenen die kunnen interfereren met de latere beeldvormingsstap en plaatst ook minder eisen aan de kwaliteit van het ontleden tang. Daarnaast beschrijven we een eenvoudige methode die gemakkelijk omkeren van de gemonteerde hersenmonsters maakt op een dekglaasje, wat belangrijk is voor het afbeelden van beide zijden van de bregens met gelijke signaalintensiteit en kwaliteit. Als voorbeeld van het protocol, een analyse van dopaminerge (DA) neuronen presenteren we volwassen hersenen van WT (w 1118) vliegt. De hoge werkzaamheid van de dissectie methode maakt het bijzonder nuttig voor grootschalige volwassen hersenen-gebaseerde studies in Drosophila.
De modelorganisme Drosophila, algemeen bekend als de fruitvlieg, is al lange tijd gewaardeerd om zijn elegante genetische instrumenten, korte reproductieve keer, en sterk geconserveerd moleculaire en cellulaire routes. De fruitvlieg is met succes toegepast om fundamentele signaalwegen, welke patroonvormende mechanismen van meercellige organismen, en de onderliggende mechanismen van neuronale ontwikkeling, functies en ziekten 1,2 ontleden. Met recente ontwikkelingen in cel labeling en beeldvormende technieken, heeft Fruitvlieghersenen bijzonder krachtig in fine mapping van neuronale circuits en het ontleden van de moleculaire en cellulaire basis van hogere hersenfuncties, zoals leren en geheugen, en circadiane ritme 1,3 worden, 4,5,6,7,8.
Een bijzonder voordeel van de Drosophila systeem is de relatief kleine omvang, waardoor whole-mount voorbereiding en onderzoek van de hersenen met behulp van een gewone verbinding of confocale microscoop. This functie maakt gedetailleerde anatomische en functionele analyse van neuronale circuits, wellicht slechts één neuron op cellulaire en subcellulaire niveaus, in de context van een hele hersenweefsel, waardoor zowel een holistische kijk op het onderzochte subject en de precieze geometrie in de hele hersenen. Echter, gezien de nogal miniatuur grootte van de hersenen, het presenteert ook een technische uitdaging in een intacte hersenweefsel efficiënt te ontleden uit de beschermende exoskelet hoofd geval in een volwassen vlieg. Verschillende effectieve en relatief eenvoudige dissectie werkwijzen zijn beschreven, die meestal betrekking voorzichtig en stapsgewijze verwijdering van de kop zaak en de omliggende weefsels zoals de ogen, de luchtpijp en vet van de hersenen juiste 9, 10. Deze microchirurgische dissectie methoden plaats vaak nogal strenge eisen aan de kwaliteit van de dissectie pincet, met een beroep op de tang met fijne goed uitgelijnd tips die gemakkelijk kunnen worden beschadigd. Bovendien, zoals de hersenen ontleed zijn vaak separated van de rest van het lichaam, kan de hersenen gemakkelijk verloren tijdens de daaropvolgende kleuring en wasprocessen vanwege hun kleine afmetingen en de transparantie bij de verwerking buffer. Hier beschrijven we een betrekkelijk eenvoudige en makkelijk te leren, éénfasige dissectie protocol voor volwassen hersenen die de hersenen ontleed aan de romp blijft. De dissectie proces is vaak gemakkelijk ruimt meeste van de hersenen weefsels zoals het oog en trachea en vermindert de vraag naar goede kwaliteit dissectie pincet.
Bovendien, bij beeldvorming van de hersenen onder de fluorescerende verbinding microscoop of confocale microscoop, de kant van de hersenen dat is verwijderd van de fluorescerende lichtbron levert vaak een zwakker signaal en minder heldere beelden doordat de dikte van de hele-mount hersenen. We beschrijven ook een eenvoudige montage methode die eenvoudig omkeren van de hersenmonsters toelaat, waardoor gemakkelijke beeldvorming aan beide zijden van de hersenen met gelijke signaal intensity en kwaliteit.
Als een proof-of-concept voor de toepassing van deze methode om de volwassen hersenen te bestuderen, we verder onderzocht op de aanwezigheid van DA neuronen in de hersenen van w 1118 vliegt; een genotype dat vaak wordt gebruikt als ouderlijn voor transgene vliegen en wildtype controle in vele studies Drosophila.
Met een toenemend belang bij volwassen Drosophila hersenen menselijke hersenziekten, neuronale circuits en hogere hersenfuncties bestuderen, is het noodzakelijk om eenvoudig en snel te ontwikkelen tot intacte fly hersenen krijgen voor hele-mount analyses, wat vooral belangrijk voor grote- schalen brain-based schermen. Onze methode biedt een eenvoudige en makkelijk te leren aanpak te ontleden uit een vlieg hoofd (vaak in minder dan 10 s met ervaring) met goed bewaard gebleven morfologie, dat is grotendeels ontda…
The authors have nothing to disclose.
Wij erkennen Mr Enes Mehmet, mevrouw Kiara Andrade, mevrouw Pilar Rodriguez, Chris Kwok, en mevrouw Danna Ghafir voor hun enorme steun aan het project.
w*; parkΔ21/TM3, P{GAL4-Kr.C}DC2, P{UAS-GFP.S65T}DC10, Sb1 | Bloomington Drosophila Stock Center | 51652 | Balancer was switched to TM6B |
PBac{WH}parkf01950 | Exelixis at Harvard Medical School | f01950 | Balancer was switched to TM6C |
NaCl | Fisher Scientific | S640-500 | |
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific | 02-003-990 | |
Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366-500 | |
Sodium phosphate, monobasic monohydrate (NaHCO3) | Fisher Scientific | 02-004-198 | |
Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | 02-003-265 | |
D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-500G | Replaces glucose |
Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
EMD Millipore Durapore PVDF Membrane Filters: Hydrophilic: 0.22µ Pore Size | Fisher Scientific | GVWP14250 | |
Formalin Solution, 10% (Histological) | Fisher Scientific | SF98-20 | |
Potassium Phosphate, Dibasic, Powder, Ultrapure Bioreagent | Fisher Scientific | 02-003-823 | |
Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
Excelta Precision Tweezers with Very Fine Points | Fisher Scientific | 17-456-055 | Protocol does not require very fine points. |
Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody | Pel-Freez Biologicals | P40101 | |
Rat-Elav-7E8A10 anti-elav | The Developmental Studies Hybridoma Bank | Clone 7E8A10 | |
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-21247 | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-11037 | |
DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
Propyl gallate powder | Sigma-Aldrich | P3130-100G | |
Glycerol ACS reagent, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | G7893-500ML | |
Zeiss Axioimager Z1 | Zeiss | Quote | |
Zeiss Apotome.2 | Zeiss | Quote | |
Zen lite software | Quote |