A method for establishing lung infections in immunocompetent rodents is described. With proficiency, this method can be performed quickly and easily to induce stable infection with many isolates of S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae and A. baumannii.
A eficácia dos tratamentos antibacterianos candidatos deve ser demonstrada em modelos animais de infecção, como parte do processo de descoberta e desenvolvimento, de um modo preferido em modelos que mimetizam a indicação clínica pretendido. Um método para induzir infecções pulmonares robustos em ratos e ratinhos imunocompetentes é descrito que permite a avaliação dos tratamentos em um modelo de pneumonia grave causada por S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, Klebsiella pneumoniae ou A. baumannii. Os animais são anestesiados, e um inoculo de ágar-base é depositado profundamente no pulmão através de intubação intratraqueal não cirúrgico. A infecção resultante é constante e reprodutível, e estável durante pelo menos 48 h e até 96 h para a maioria dos isolados. Estudos com antibacterianos comercializados têm demonstrado boa correlação entre a eficácia in vivo e in vitro susceptibilidade, e concordância entre farmacocinética / farmacodinâmica alvos determinadosneste modelo e alvos clinicamente aceites tem sido observado. Embora não haja um investimento de tempo inicial quando a aprendizagem da técnica, pode ser realizada rápida e eficiente uma vez que a proficiência é alcançada. Benefícios do modelo incluem a eliminação da exigência de neutropenia, o aumento da robustez e reprodutibilidade, capacidade de estudar mais patógenos e isola, maior flexibilidade no desenho do estudo e estabelecimento de uma infecção desafiador em um hospedeiro imunocompetente.
Avaliação da eficácia de potenciais candidatos de drogas em modelos animais de infecção é um componente crítico do processo de descoberta de drogas anti-bacteriano. In vivo os estudos de eficácia fornecer dados importantes para toda a extensão dos esforços de descoberta, de elucidar relações estrutura-actividade (SAR) e otimizar série química chumbo através da determinação farmacocinética-farmacodinâmica (PK / PD) características dos compostos e apoiar a selecção da dose para a tomada de decisão desenvolvimento clínico e aprovação regulamentar. Numerosos modelos de infecção de animais estão descritos na literatura para estes fins. Um dos modelos mais comuns e amplamente utilizados é a infecção do mouse coxa neutropenia, que foi lançada pela Águia 1, 2 e mais tarde expandiu-se Vogelman e Craig 3, 4. Este modelo tem sido inestimável para apoiar a determinação dos limites de susceptibilidade bacteriana e para fornecer metas de PK / PD para orientar a dosagem humana. Existem muitos examepios em que a capacidade preditiva do modelo foi provado 4-7. No entanto, um dos inconvenientes do modelo de infecção coxa é a falta de relevância directa para infecções pulmonares. Existe agora um maior ênfase na correspondência do local da infecção em modelos animais para o local da infecção em seres humanos; e, assim, estudar a compostos para o tratamento de pneumonia, que é ideal para utilizar um modelo de infecção pulmonar em animais.
Vários métodos para a indução de infecções pulmonares em animais de laboratório foram descritos e utilizados para estudos de eficácia antibacterianos incluindo a inalação intranasal, a aspiração através da via orofaríngea, exposição ao aerossol, e cirúrgica inoculação intratraqueal 8. Em muitos casos, os animais (ratos) em particular deve primeiro ser tornado neutropenia, a fim de alcançar uma infecção pulmonar robusta. Apesar deste estado gravemente imunocomprometidos, o número de agentes patogénicos bacterianos e as estirpes que produzem infecções viáveis é em roedoreslimitado. Por exemplo, pode ser difícil estabelecer com sucesso Haemophilus influenzae ou Acinetobacter baumannii em modelos pneumonia 9, 10, e patógenos ainda mais virulentos, tais como Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa e Klebsiella pneumoniae, podem representar desafios 11-13.
Em 1991, Smith descreveu um modelo de infecção pulmonar em ratos recém-desmamados imunocompetentes em que a infecção foi estabelecida por incutir bactérias directamente para os pulmões por meio de um método não cirúrgico simples intubação intratraqueal 14. Berry et al. posteriormente modificado o método para infectar ratos 15. Usando um inoculo de ágar-base, esta técnica de inoculação induz infecções pulmonares robustas tanto em ratos imunocompetentes e ratinhos com S. pneumoniae, H. influenzae, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii. É favorável para uma grande variedade de isolados, incluindo aqueles abrigando vários resistirdeterminantes Ance e aquelas que não produzem uma infecção viável por outras vias de inoculação. Ele também permite que a eficácia deve ser determinada em animais imunocompetentes, uma condição que é mais relevante do que o modelo do rato neutropênica tradicional para populações de pacientes que não estão gravemente imunocomprometidos. A consistência e confiabilidade deste modelo em vários patógenos e isolados torna adequado para estudos de eficácia antibacterianos.
Para o sucesso ideal em reproduzir este modelo de infecção, as seguintes sugestões adicionais devem ser considerados. Virulência de novos isolados pode ser melhorada por passagem de 2 – 3 vezes in vivo antes da utilização num estudo. Stocks bacterianas congeladas devem sempre ser preparado a partir de uma primária in vivo fonte -derived com o menor número de passagens quanto possível do original, e recongelar ou reutilização de estoque descongelado é desencorajado. Usando isolados clínicos recentes recuperadas a partir de pacientes com pneumonia e / ou preparação de culturas em fase log de crescimento também pode ajudar a melhorar o estabelecimento da infecção. Uma diluição de cinco vezes no agar (por exemplo, 2 ml de suspensão salina adicionado a 8 ml de agar) pode ser usado em vez de dez vezes para aumentar o inoculo bacteriano, e o volume de inoculo pode ser ajustada com base no tamanho do animal (por exemplo, 200 uL / animal é geralmente inoculado em ratos 250 g). Antes da adição da suspensão bacteriana em soro fisiológico aágar (isto é, no Passo 2.3), a densidade bacteriana pode ser prevista ou estimada por inspecção visual, padrões MacFarland ou medições de densidade óptica. É útil para se familiarizar com as características de crescimento in vitro para cada isolado antes da realização de experimentos in vivo. Consistência no crescimento e manuseamento permite a estimativa mais precisa da densidade bacteriana para qualquer dado isolado. métodos microbiológicos padrão que diferem daqueles descritos, tais como meios de comunicação e homogeneizadores de tecido alternativa, podem ser utilizados como apropriados para a preparação de inóculos e enumeração de bactérias a partir de tecidos infectados.
É altamente recomendável para preparar ou derreter o agar do dia antes da experiência, e armazená-la durante a noite num banho de água separada definida para 50 ° C. Isto vai simplificar o processo e ajudar a proteger contra o agar ser demasiado quente no momento da infecção. A temperatura de 41-42 ° C constitui um bom equilíbrio entre a manutenning o agar em estado líquido, sem ser demasiado quente para a sobrevivência bacteriana de curto prazo. Como uma alternativa possível à de agar nutriente, ágar nobre tem sido utilizada com sucesso em algumas experiências. Um tubo de inoculo de ágar é geralmente suficiente para um experimento inteiro (e é recomendado), mas vários tubos podem ser preparados para infectar um grande número de animais (por exemplo, mais de 60) ou quando o processo de infectar demora mais do que 30 – 45 min Se múltiplos tubos de inóculo são necessários, adicionar a suspensão bacteriana solução salina a cada tubo de agar tal como é necessário. Isto reduz o risco de que a sobrevivência e / ou a forma física bacteriana irá ser afectada pela exposição prolongada a uma temperatura elevada antes da inoculação. Deve notar-se que o uso de vários tubos de inoculo pode também requerer procedimentos de randomização animais adicionais. Sempre que possível, infectar todos os animais a partir da mesma preparação de inoculo. Recomenda-se a adaptar o tamanho de experimentos para o nível atual de proficiência com o technique.
Um cientista especialista pode intubação e inocular um animal em menos de 30 s, e inocular até 5 – 6 animais por lote (isto é, com uma seringa cheia de inoculo de ágar). Para aqueles que aprender a técnica, a velocidade é importante como o agar vai começar a solidificar; No entanto, a colocação precisa do inoculo é mais importante. Comece com 1 ou 2 animais por lote, e aumentar à medida que a técnica torna-se mais familiar. Os animais continuam a respirar durante a intubação; Assim, a janela de tempo para a inoculação depende da rapidez com que o animal recupera de isoflurano, o que deve ser de aproximadamente 2-3 min. Os animais que despertam durante o processo pode ser re-anestesiados e tentado uma segunda vez, mas isto não é recomendado para o fazer repetidamente. inoculação bem sucedida na primeira tentativa, é esperado em quase 100% dos animais uma vez proficiência é alcançada. Note-se que é mais fácil de aprender a técnica utilizando ratos em primeiro lugar; ratinhos são mais delicados e muito menorls são mais propensas ao bloqueio com agar solidificado se não for manipulado rapidamente. seringas pré-aquecimento, tubos e salinas, bem como manter o dispositivo de intubação em uma superfície quente (não quente), como uma almofada de aquecimento em baixa definição, podem ajudar a prevenir a solidificação do agar. Quando a aprendizagem da técnica, também é útil para a prática de colocação adequada do inoculo utilizando um corante de cor escura (tais como azul de metileno concentrado) em vez da suspensão bacteriana em ágar. Realizar o processo tal como descrito, mas sacrificar o animal imediatamente após a inoculação do corante (não permitindo que o animal recuperar da anestesia e eutanásia). Dissecar a determinar onde o corante foi colocado, e ajustar em conformidade técnica.
O endpoint primário neste modelo é CFU dos pulmões infectados. A sobrevivência não é um bom indicador da carga bacteriana e não é um desfecho recomendado. Para os estudos de eficácia, o N sugerida é de 5 – 6 animais por grupo como este é predicted para detectar diferenças de log ≥1 10 CFU entre grupos com pelo menos 90% de energia. Os animais podem ser infectados em grupos de tal forma que permanecem em conjunto companheiros de gaiola, ou um verdadeiro processo de randomização pode ser seguido. Note que se os grupos são designados por gaiola, os grupos deve ser infectado numa sequência aleatória com os controlos de crescimento de fim de estudo última infectadas (para confirmar que a sobrevivência bacteriana / aptidão não foi afectada pelo comprimento de tempo de exposição a uma temperatura elevada no banho de água). Nenhum método de censura dados deve ser necessário, e nenhum é recomendada, com excepção da remoção imediata de qualquer animal que tenha sido obviamente mis-inoculados no início do estudo (antes do início de quaisquer tratamentos). Os animais que são sacrificados antes do final do estudo deve ser amostrada e resultados incluídos no conjunto de dados, a menos que uma razão válida para exclusão prospectivamente foi identificado (isto é, um evento não relacionado com o tratamento ou infecção). carryover droga pode affect algumas amostras e é uma consideração importante em todos os modelos de infecção in vivo. Se um composto é dada frequência, perto da hora da eutanásia ou tem uma semi-vida longa, pode estar presente no homogenato de tecido a uma concentração suficientemente elevada para continuar a matar bactérias ex vivo durante o processo de enumeração de bactérias (diluição e plaqueamento de as amostras ou sobre as placas de agar durante a incubação durante a noite). Para evitar isso, carvão activado e / ou um aditivo que degrada a molécula activa, sem prejudicar as células bacterianas podem ser adicionados à amostra antes da homogeneização. Outros métodos incluem a centrifugação das amostras para remover a maioria do composto activo (o qual deve permanecer no sobrenadante) e empregando diluição diferente e plaqueamento regimes suficientemente para diluir o composto activo a uma concentração não inibidora.
Como evidenciado pelos exemplos mostrados na Figura 2, este modelo com sucesso induces infecções pulmonares em roedores com uma ampla gama de organismos incluindo aqueles que não crescem bem em outros modelos (por exemplo, H. influenzae). Estas infecções são consistente e reprodutível, reduzindo a probabilidade de que as experiências terá de ser repetido devido à falha de modelo e / ou pobre desempenho com um dado isolado. Embora os animais são imunocompetentes, eles são incapazes de resolver rapidamente a infecção, se em tudo. Isto permite uma maior flexibilidade na duração do estudo, tal como muitos isolados manter uma infecção viáveis através de pelo menos 96 horas sem a necessidade de injecções repetidas para manter a neutropenia. A vantagem potencial de estudar a eficácia antibacteriana em animais imunocompetentes foi observado anteriormente 20, 21, e há evidências de que, para alguns compostos (por exemplo, oxazolidinonas), os dados a partir de roedores não neutropénicos pode prever com maior precisão alvos de exposição humanos em comparação com aqueles neutropénicos rendeu 5. O utilitário multi-propósito de tEle modelo é demonstrado nas Figuras 3 e 4 e as Tabelas 1 e 2. Estes estudos são parte de uma grande coleção de dados publicados e não publicados que foi gerado com este modelo para apoiar os esforços de otimização de chumbo 16, 17, 22-24, para comparação e confirmação da dosagem humana propostos esquemas 19, 25-29 e para a caracterização de PK / PD 18, 30-32 .enquanto este modelo é inicialmente mais complexo de realizar em comparação com o método de inalação intranasal, existem muitas vantagens descritas acima. Com prática e uso rotineiro, as técnicas devem tornar-se simples de executar.
Pode notar-se, em alguns estudos que a carga bacteriana na linha de base era menor do que a normalmente orientada em outros modelos de infecção pulmonar. Isto é devido em grande parte à diluição necessária em agar e o volume desafio pequeno, particularmente em ratos. No entanto, também deve ser notadoque o crescimento bacteriano foi observado em todos os casos, mesmo quando a carga inicial era relativamente baixa. A carga bacteriana de base alvo é 6 a 6,5 log 10 CFU / pulmões (6,8 a 7,3 log 10 UFC / g de tecido em ratinhos baseados em pesos médios do pulmão) que corresponde a densidades estimadas em pacientes humanos com pneumonia grave 33. Uma carga de linha de base superior pode ser alcançado por concentração adicional do inoculo bacteriano ou atrasar o início da administração do composto para permitir o crescimento bacteriano adicional; No entanto, o aumento da carga de desafio em excesso pode levar a doença grave e anormalmente aguda (ou seja, morte em menos de 24 h), que é refractário a todos os tratamentos antibacterianos independentemente de susceptibilidade. Embora o inoculo é inicialmente colocado preferencialmente no pulmão esquerdo do animal, geralmente a infecção se espalha por ambos os pulmões. doença progressiva do pulmão, a disseminação das bactérias a outros órgãos, e eventual morbilidade é muitas vezes observed com S. pneumoniae, K. pneumoniae e P. aeruginosa. De interesse, infecções com H. influenzae e A. baumannii são geralmente mais contido e raramente levar à morte no inóculos bacterianos prescrito.
Os resultados de eficácia obtidos com este modelo tem demonstrado boa correlação com in vitro perfis de susceptibilidade, bem como metas PK / PD definidos. Reduções na carga bacteriana são rotineiramente observada para isolados consideradas susceptíveis ao agente a ser testado, enquanto que as consideradas resistentes exibem nenhuma mudança ou crescimento bacteriano acima da linha de base 16, 17, 19, 24-29. Estudos em ratos avaliando dois quinolonas e um macrólido de utilizar este modelo de 32 mostraram que o alvo de PK / PD necessário para um 1-log 10 redução em S. pneumoniae em comparação com os valores basais correlacionada com o alvo determinada em ratinhos neutropénicos e, mais importante ainda, com alvos clínicos para pneum bacteriana adquirida na comunidadeonia 6, 7, 34, 35. Gepotidacin, um mecanismo novo antibiótico, foi testada contra vários S. pneumoniae e necessário um alvo PK / PD semelhante para um 1-log 10 redução neste modelo de infecção pulmonar 31 que o exigido para um 1-log 10 redução no modelo da coxa neutropénicos 36 quando a penetração de pulmão foi tida em conta (dados em arquivo). Do mesmo modo, os objectivos de PK / PD para determinados em ratinhos GSK2251052 contra P. aeruginosa foram consistentes para estase, 1- e 2-log em CFU 10 reduções entre este modelo de pulmão 30 e o modelo de infecção coxa neutropénicos quando a penetração pulmonar foi considerada 37, 38 . Correlação com um modelo de infecção pulmonar neutropênica usando inoculação intranasal era pobre; no entanto, GSK2251052 não produzir mais do que uma resposta estática nesse estudo 38. Isto pode ser atribuível ao inoculo bacteriano superior, que foi de 8 log 10 UFC / murganho, em comparação com 6 log <sub> 10 UFC / rato na coxa neutropenia 37 e intratraqueal intubação 30 modelos. Recolha de dados como este é fundamental para a avaliação comparativa, já que permite a comparação directa com os modelos e correlação com dados clínicos existentes para avaliar a capacidade preditiva de translação. utilização mais generalizada do modelo de infecção pulmonar de intubação orotraqueal irá fornecer dados adicionais para estes tipos de análises.
Existem várias limitações deste modelo de pneumonia imunocompetentes. Em primeiro lugar, não é bem adequado para avaliar o surgimento de resistência espontânea porque o inoculo bacteriano alta geralmente exigido para tais estudos resulta em uma infecção muito grave. Na sequência de tentativas para conseguir cargas bacterianas de 7 ou 8 log 10 CFU no início do estudo, a morbidade rápida tem sido observado (ou seja, animais tornando-se moribunda em menos de 24 h), apesar de lavagem completa dos inóculos para remover toxinas pré-existentes (dados em arquivo). istopode ser possível superar esse problema usando roedores maiores. Ratos, ratazanas especialmente mais pesados (> 250 g), parecem tolerar melhor inóculos maiores, em comparação com os ratos e pode ser adequado para estes tipos de estudos. Uma segunda limitação é que a utilização de uma infecção de agar como potenciador pode excluir a utilização do modelo para a avaliação de certos hospedeiro: agente patogénico. Acredita-se que o agar fornece um ponto focal protegida até que a infecção está totalmente estabelecida no interior do pulmão. É possível entregar o inóculo em solução salina em vez de agar para ajudar a superar este problema; No entanto, deve notar-se que isto apenas irá produzir infecção com alguns isolados. Em terceiro lugar, há uma curva de aprendizagem necessária para se tornar proficientes na técnica. O procedimento pode ser delicada, especialmente em ratinhos. É fácil colocar erroneamente a cânula de metal para o esôfago e força excessiva poderá causar perfuração, quer do esófago ou da traqueia. colocação cuidadosa do inoculo é igualmenterequerido ou animais podem ou não se recuperar ou não ser adequadamente infectadas. No entanto, com paciência e perseverança, pode tornar-se altamente proficiente e executar a técnica rápida, suave e precisa.
Ao eliminar a necessidade de neutropenia, aumentando a robustez e reprodutibilidade, permitindo que os investigadores a estudar mais patógenos e isolados, melhorando a flexibilidade do design experimental e proporcionando uma infecção difícil de caracterizar farmacodinâmica para pneumonia, este modelo infecção pulmonar imunocompetentes agrega valor substancial para a descoberta de antibióticos comunidade. O aumento da utilização deste modelo por investigadores adicionais ajudará a fornecer a avaliação comparativa necessária para que adquiram uma aceitação mais ampla e continuar a fornecer informações de suporte para a interpretação apropriada.
The authors have nothing to disclose.
JH deseja reconhecer e agradecer mentor, amigo e ex-gerente Valerie Berry para o primeiro nos ensinando este modelo; e Gary Woodnutt, que nos ensinou os fundamentos do e inspirou o nosso compromisso com o campo de PK / PD antibacteriano. Todos os autores gostariam de agradecer David Payne por seu apoio e valorização de nossa ciência. Gostaríamos de reconhecer a nossa ex-nos colegas vivo microbiologia que contribuíram para o corpo de dados gerados através destes métodos, especialmente Pete DeMarsh, Rob Straub, Roni página e Nerissa Simon. Finalmente, os nossos agradecimentos vão para os nossos in vitro colegas de microbiologia para a sua assistência, especialmente para fornecer todos os MICs nós pedido (Lynn McCloskey, Josh Oeste e Sharon Min); e para a nossa equipe de microbiologia clínica que oferece consultoria especializada e suporte (Linda Miller, Nicole Scangarella-Omã e Deborah Butler).
TSA II Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | Becton Dickinson and Company | 4321261 | |
Chocolate II Agar | Becton Dickinson and Company | 4321267 | |
BBL Brain Heart Infusion Broth Modified | Becton Dickinson and Company | 299070 | |
BBL Trypticase Soy Broth with 20% Glycerol | Becton Dickinson and Company | 297808 | storage media for frozen stock |
Inoculating loop | Nunc | 251586 | |
0.9% Sodium Chloride, USP | Baxter Healthcare Corporation | NDC 0338-0048-04 | |
Difco Nutrient Agar | Becton Dickinson and Company | 213000 | |
30 ml free standing centrifuge tube with cap | EverGreen Scientific | 222-3530-G80 | |
50 ml Polypropylene Conical Tube 30 x115mm | Falcon, a Corning Brand | 352070 | |
14 ml Polypropylene Round-Bottom Tube 17 x 100mm | Falcon, a Corning Brand | 352059 | |
Guide Tool | Intek Services Ltd | GT01 | custom-made metal cannula for rats |
90' Portex tubing | SAI | POR-080-100 | plastic cannula for rats |
1 ml TB syringe slip tip | Becton Dickinson and Company | 309659 | |
PrecisionGlide Needle 25G x 5/8 | Becton Dickinson and Company | 305122 | |
Animal feeding needle – straight 20×3" 2-1/4 | Popper and Sons, Inc | 7903 | used to create metal cannula for mice |
Intramedic polyethylene tubing | Clay Adams brand – Becton Dickinson and Company | 427401 | plastic cannula for mouse |
75 TN 5.0ul syringe 26s/2"/2 | Hamilton | 87930 | HPLC glass injection syringe |
Pyrex tube, culture 25×150 screwcap with rubber liner | Corning | 9825-25 | to autoclave/store metal cannulae |
70% isopropyl alcohol | Vi-Jon (Swan) | NDC 0869-0810-43 | |
Isoflurane, USP | Piramal Healthcare | NDC 66794-013-10 | |
Stomacher | Seward | Stomacher80 | |
Stomacher 80 classic bags | Seward | BA6040 | |
Assay plate, 96 well, round bottom | Costar, Corning Inc | 3795 | optional, for serial diluting |
Blood Omni Plates | Hardy | #A127 | optional, rectangular blood plates |