A method for establishing lung infections in immunocompetent rodents is described. With proficiency, this method can be performed quickly and easily to induce stable infection with many isolates of S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae and A. baumannii.
후보 항균 처리의 효과는 바람직하게 의도 된 적응증을 모방 모델의 탐색 및 개발 프로세스의 일부로서 감염의 동물 모델에서 입증되어야한다. 면역 쥐와 생쥐에서 강력한 폐 감염을 유도하는 방법은 S. pneumoniae에, H. 인플루엔자, 녹농균, K. pneumoniae에 또는 A. baumannii가에 의한 심각한 폐렴의 모델에서 치료의 평가를 위해 할 수있는 기술되어있다. 동물을 마취 한 한천 기반 접종 비수술 기관 내 삽관을 통한 폐 깊숙이 증착된다. 그 결과 감염은 일관 재현, 적어도 48 시간 동안 안정적이고 대부분의 균주에 대한 96 시간에 달려있다. 판매 항균제와 연구는 생체 내 효능 사이 체외 감수성에 좋은 상관 관계를 입증 및 약동학 / 약력 학적 목표와 일치 결정이 모델 및 임상 허용 대상에서 관찰되었다. 기술 학습 초기 시간 투자가 있지만 능력이 달성되면, 신속하고 효율적으로 수행 될 수있다. 이 모델의 장점은 호중구 감소증 요구 사항의 제거, 증가 된 견고성과 재현성, 더 많은 병원균과 분리, 면역 호스트의 연구 설계 및 도전 감염의 설립에 향상된 유연성을 연구하는 기능이 포함됩니다.
감염의 동물 모델에서의 잠재적 인 약물 후보의 효능을 평가하는 항균 약 발견 과정의 중요한 요소이다. 생체 내에서 효능 연구에 대한 중요한 데이터를 제공하는 의사 결정 (SAR) 구조 – 활성 관계를 해명에서 발견 노력의 범위에 걸쳐 및 약동학 – 약력학을 결정 (PK / PD)를 통해 화합물의 특성을 리드 화학 시리즈를 최적화하기위한 용량 선택을 지원 임상 개발 및 규제 승인. 수많은 동물 감염 모델은 이러한 목적을 위해, 문헌에 기재되어있다. 가장 일반적이고 널리 이용되는 모델 중 하나는 Vogelman 크레이그 3,4- 의해 확장 이후 이글 (1, 2)에 의해 개척 된 호중구 감소 마우스의 대퇴부 감염이다. 이 모델은 세균의 감수성 중단 결정을 지원하기위한 인간의 투약을 안내하는 PK / PD 목표를 제공하기위한 귀중한하고있다. 많은 시험이있다PLES이 모델의 예측 능력은 4-7 입증 된 경우. 그러나, 대퇴부 감염 모델의 단점 중 하나는 폐 감염 직접적인 관련성이 부족하다. 인간의 감염 부위로의 동물 모델 감염 부위의 일치 더 강조 해주기있다; 따라서, 폐렴의 치료를위한 화합물을 공부하기 위해서는 동물에서 폐 감염 모델을 이용하는 것이 적합하다.
실험 동물의 폐 감염을 유도하기위한 여러 가지 방법을 설명하고 비강 흡입, 인두 경로를 통해 흡입, 에어로졸 노출, 수술 기관 내 접종 (8)를 포함하는 항균 효능 연구에 사용되어왔다. 많은 경우에서, 동물 (특히, 쥐)를 첫 번째 견고한 폐 감염을 달성하기 위해 호중구 렌더링되어야한다. 이 심각 면역 상태에도 불구하고, 설치류에서 가능한 감염을 생산하는 박테리아 병원균과 균주의 수입니다제한된. 예를 들어, 도전 11-13을 초래할 수 있고, 성공적으로 폐렴 모델 9, 10, 및 폐렴 구균, 녹농균 및 폐렴 간균으로서 더욱 병원성 병원균에 인플루엔자 균 또는 아시네 토 박터 바우 마니를 확립하는 것이 어려울 수있다.
1991 년 스미스는 감염이 간단한 비수술 기관 내 삽관 법 (14)를 통해 폐에 직접 세균을 주입에 의해 설립되었다하는 면역 젖을 갓 뗀 쥐에서 폐 감염 모델을 설명했다. 베리 등. 나중에 마우스 (15)를 감염하는 방법을 수정했습니다. 한천 기반 접종을 사용하여,이 접종 기술은 S. pneumoniae에, H. 인플루엔자, K. pneumoniae에, 녹농균 및 A. baumannii가와 모두 면역 쥐와 생쥐의 강력한 폐 감염을 유도한다. 다양한 레지스트 은닉을 포함한 균주의 넓은 범위에 의무가ANCE의 결정과 다른 접종 경로를 통해 실행 가능한 감염을 생성하지 않는 것들. 또한, 효능은 면역 동물에서 결정되는 심각한 면역하지 않은 환자 집단에 대한 기존의 호중구 마우스 모델보다 더 많은 관련 조건을 수 있습니다. 여러 병원균과 분리를 통해이 모델의 일관성과 신뢰성은 항균 효능 연구에 적합합니다.
이 감염 모델의 재생에 최적의 성공을 위해, 다음과 같은 추가 제안 사항이 고려되어야한다. 연구에서 이전에 사용에 대한 생체 내에서 3 회 – 새로운 균주의 독성은 2 계대에 의해 강화 될 수있다. 냉동 세균성 주식은 항상 원본과 가능한 한 적은 수의 통로로 유도 된 소스 생체 내에서 기본부터 제조하고, 재 냉각 또는 고정 해제 주식의 재사용을 권장하지 않습니다해야합니다. 로그 상 성장 배양 폐렴 환자로부터 회수 된 최근 임상 분리를 사용하여, 및 / 또는 제조하면 감염의 확립을 개선하는데 도움이 될 수있다. 한천 (예 : 2 mL의 생리 식염수 현탁액을 8 mL의 한천을 첨가)으로 5 배 희석 대신 사용될 수있다 (박테리아 접종원을 높이기 위해 10 배 및 접종 볼륨 조절이 동물의 크기에 기초 할 수있다 예를 들어 200 μL는 / 동물은 일반적으로) 250g 쥐에 접종한다. 에 식염수 세균 현탁액을 추가하기 전에한천 (즉, 단계 230에서), 균체 밀도 예측 또는 육안 검사, MacFarland 표준 또는 광학 밀도를 측정함으로써 추정 될 수있다. 각각의 생체 실험 실시 이전에 분리의 체외 성장 특성을 숙지하는 것이 도움이된다. 성장과 처리의 일관성은 주어진 분리에 대 한 세균 밀도가 가장 정확한 추정을 가능하게한다. 이러한 매체 및 조직 균질 대안으로, 기재된 것과 다를 표준 미생물 학적 방법, 접종원 제조 감염된 조직에서 박테리아를 열거하기 위해 적절하게 사용될 수있다.
매우 준비하거나 실험 전날 한천을 녹여 50 ° C로 설정 별도의 수조에서 하룻밤 보관하는 것이 좋습니다. 이것은 프로세스를 단순화 및 한천 감염시 과열되는 대해 보호를 도울 것이다. (41)의 온도 – 42 ° C는 maintai 사이의 균형을 달성닝 단기 박테리아 생존을위한 과열되지 않고 액체 상태의 한천. 영양 배지에 가능한 대안으로서, 귀금속 한천 성공적 일부 실험에 사용되었다. 한천 접종 중 하나 튜브는 전체 실험에 충분합니다 (권장한다), 그러나 다수의 튜브는 동물의 많은 수의 감염에 대한 제조 할 수있다 (예 : 60) 또는 감염 과정은 더 이상 30 이상 걸리는 경우 – 45 분이면 다중 접종 튜브가 필요로 한천 각 튜브에 식염수 세균 현탁액을 추가해야한다. 이 박테리아 생존 및 / 또는 적합성을 접종하기 전에 고온에 장시간 노출에 의해 영향을받을 위험을 줄일 수 있습니다. 이 접종하여 다중 튜브 추가적인 동물 무작위 화 절차가 필요할 수 있다는 것을 주목해야한다. 가능하면, 동일한 접종 준비의 모든 동물을 감염. 테와 능력의 현재 수준 실험의 크기를 조정하는 것이 좋습니다chnique.
숙련 된 과학자 삽관 미만 30 초에 동물을 접종하고 5까지 접종 할 수 있습니다 – (한천 접종 가득 한 주사기 예) 배치 당 6 동물. 기술을 배우는 사람들을 위해, 속도가 응고되기 시작합니다 한천 중요하다; 그러나 접종의 정확한 배치가 더욱 중요하다. 배치 당 1 개 또는 2 동물로 시작하고, 기술에 익숙해 질수록 증가한다. 동물들은 삽관 동안 호흡을 계속; 3 분 – 따라서, 접종에 대한 시간 창은 동물이 약 2해야 이소 플루 란에서 회복하는 속도에 따라 달라집니다. 과정 각성 동물은 다시 마취와 두 번째 시도 있지만 그렇게 반복하지 않는 것이 좋습니다 수 있습니다. 능력이 달성되면 첫 번째 시도에서 성공 접종은 동물의 거의 100 %가 예상된다. 먼저 쥐를 사용하여 기술을 쉽게 배울 수 있습니다; 생쥐보다 섬세하고 너무 작아LS 빠르게 조작하지 않을 경우 응고 한천으로 차단하는 것이 더 쉽다. 사전 온난화 주사기, 튜브 및 염분뿐만 아니라 낮은 설정에 가열 패드와 같이 따뜻한 (뜨겁지 않은) 표면에 삽관 장치를 유지하는 등, 한천의 응고를 방지 할 수 있습니다. 기술을 학습하면, 어두운 색의 염료 (예 농축 메틸렌 블루 등) 대신에 한천의 세균 현탁액을 이용하여 접종의 적절한 배치를 연습하는 것도 유용하다. 즉시 염료 접종하기 (동물이 마취 안락사 사이에 복구 할 수 없음) 동물 바와 같은 절차를 수행하지만, 안락사. 염료가 배치 된 위치를 확인하고 그에 따라 기술을 조정 해부.
이 모델의 주요 엔드 포인트는 감염된 폐에서 CFU입니다. 생존 세균 부담 좋은 지표 아니며 추천 끝점 아니다. 이 predicte 같이 그룹당 6 동물 – 효능 연구를 위해 제안 된 N이 5 인D는 적어도 90 %의 전력으로 ≥1 로그를 군간 10 CFU 차이를 검출한다. 동물 케이지 동료가 함께 남아, 또는 진정한 무작위 과정을 준수 할 수 있도록 그룹에 감염 될 수있다. 기가 케이지에 의해 할당 된 경우 그룹을 마지막으로 감염된 끝 연구 성장 컨트롤 임의 순서로 감염되어야합니다 (즉 박테리아의 생존을 확인 / 니스가 상승 된 온도에 노출 된 시간의 길이에 의해 영향을받지 않았다 물 목욕). 데이터의 검열 방법이 필요 없을 것, 그리고 아무도 잘못 접종 연구의 시작 부분에 (이전에 모든 치료의 시작에) 분명히했습니다 어떤 동물의 즉각적인 제거를 제외하고 권장되지 않습니다. 연구 종료 전에 안락사되는 동물 샘플링되어야하고 결과를 제외 할 타당한 이유가 전향 적으로 확인되지 않는 한 데이터 세트에 (감염 또는 치료 관련이없는 즉, 이벤트)을 포함. 약 이월 할 수있다 AFF요법 몇 가지 샘플 모든 생체 내 감염 모델에서 중요한 고려 사항이다. 화합물이 안락사시에 자주 근접 주어진 또는 긴 반감기를 갖고 있으면 (박테리아 열거 프로세스 중에 박테리아 생체 죽이고 희석 도금 계속 충분히 높은 농도로 조직 파쇄에 존재할 수있다 하룻밤 배양하는 동안 한천 플레이트에 샘플 또는). 이 활성탄 및 / 또는 균질화하기 전에 샘플에 첨가 될 수있는 박테리아 세포를 해치지 않고 활성 분자를 분해 첨가제를 방지 할 수있다. 다른 방법 (상청액에 남아 있어야) 활성 화합물의 대부분을 제거하기 위해 샘플을 원심 분리하고 서로 다른 희석을 이용하여 충분히 비 억제 농도의 활성 화합물을 희석시키는 방식 도금 포함한다.
난,도 2에 도시 된 실시 예에서,이 모델을 성공적으로 입증다른 모형 (예를 들면 H. 인플루엔자)에서 성장하지 않는 것들을 포함 유기체의 광범위한 설치류에서 폐 감염을 nduces. 이러한 감염은 실험이 주어진 분리와 모델 오류 및 / 또는 성능 저하로 인해 반복해야하는 가능성을 감소, 일관되고 재현 할 수 있습니다. 동물 면역 있지만, 그들은 모든 경우 신속하게 감염을 해결 할 수 없습니다. 이것은 많은 균주가 반복 주사 호중구를 유지할 필요없이 적어도 96 시간을 통해 가능한 감염을 유지 같은 연구 길이 향상된 유연성을 허용한다. 면역 적격 동물에서의 항균 효과를 연구의 잠재적 이점은 이전에 21 20 주목 받고 있으며, 일부 화합물 (예를 들면 옥사 졸리 디논)을 위해 비 호중구 설치류 데이터 더 정확하게 그 렌더링 호중구 비하여 인체 노출 타겟을 예측할 수 있다는 증거가있다 5. t의 범용 유틸리티비교를 위해, 리드 최적화 작업 (16) (17)을 지원하기 위해 모델에 의해 생성 된 문서 및 미공개 많은 데이터 수집, 22-24 부분 그 모델이도 3 및도 4 및 표 1 및 2 이들 연구에서 입증되어있다 상술 한 바와 같이 제안 된 인간의 투여 확인 19, 25 ~ 29과 PK의 /의 PD 특성 (18)가, 30 ~ 32 .WHILE이 모델이 처음 비강 흡입 방법과 비교하여 수행하는 것이 더 복잡식이 요법, 많은 혜택이 있습니다. 연습과 일상적인 사용으로, 기술을 수행 할 수 간단하게한다.
그것은 기준의 세균 부담이 일반적으로 다른 폐 감염 모델에서 대상보다 낮았다 일부 연구에서 언급 할 수있다. 특히 마우스의 한천에 필요한 희석 및 작은 도전 볼륨에 상당 부분 기인한다. 그러나, 그것은 또한 주목해야그 세균 성장 초기 부하가 비교적 낮은에도 모든 경우에 나타났다. 대상 기준 박테리아 부하는 6 중증 폐렴 (33)와 인간의 환자에서 추정 밀도에 해당하는 10 CFU / 폐 (6.8 로그 평균 폐 가중치에 따라 마우스에서 조직의 10 CFU / g 7.3) 로그 6.5. 높은 기준선 부담 상기 세균 접종 물을 농축시켜 추가 또는 세균의 성장을 허용하는 화합물 투여의 시작을 지연시킴으로써 달성 될 수있다; 그러나, 너무 많은 도전 부하의 증가에 관계없이 감수성의 모든 항균 치료에 불응하다 비정상적으로 심한 급성 질환 (이하 24 시간에 즉 죽음)으로 이어질 수 있습니다. 접종이 초기 동물의 왼쪽 폐에 우선적으로 배치되어 있지만, 감염은 일반적으로 양쪽 폐에 걸쳐 퍼진다. 진보적 인 폐 질환, 다른 기관에 박테리아의 보급, 그리고 궁극적으로 이환율은 종종 observ입니다S. 폐렴, K. pneumoniae에와 녹농균과 에디션. 관심, H. 인플루엔자와 A. baumannii가와 감염은 일반적으로 더 포함 된 거의 소정의 세균 접종에 사망에이를 수 없습니다.
이 모델에서 얻은 효능 결과는 시험 관내 감수성 프로필뿐만 아니라 정의 PK / PD의 목표와 잘 상관 관계가있다. 세균 부담의 감소는 정기적으로, 테스트중인 에이전트에 민감 간주 분리 관찰되어 그 생각에 강한 전시 기준 16, 17, 19, 24 ~ 29 위의 변화없이 또는 박테리아 성장하면서. 두 퀴놀론이 모델 (32)를 사용하여 마크로 라이드를 평가 쥐 연구에 필요한 PK / PD의 대상이와 함께, 호중구 감소증 마우스에서 결정된 타겟과, 더 중요한 상관 관계를베이스 라인과 비교하여 S. 폐렴 10 감소 1 로그 것으로 나타났습니다 지역 사회 획득 세균성 pneum 임상 대상onia 6, 7, 34, 35. Gepotidacin, 새로운기구 항생제, 여러 S. pneumoniae에 대해 테스트 및 호중구 허벅지 모델 1 로그 (10)의 감소에 필요한 것과이 폐 감염 모델 (31)에 1 로그 (10) 감소 비슷한 PK의 /의 PD 대상이 필요했다 36 폐 침투가 고려되었다 (파일 데이터). 폐 침투 37을 고려했을 때 유사하게, 녹농균에 대한 GSK2251052에 대한 마우스에서 결정된 PK / PD 대상은 38 정체, 1이 폐 모델 (30)와 호중구 허벅지 감염 모델 사이 CFU 10 감소 (2) – 로그에 대한 일치했다 . 가난 비강 접종을 사용하여 호중구 폐 감염 모델과 상관 관계; 그러나, GSK2251052는 연구 (38)의 정적 응답보다 더 생산하지 않았다. 이 6 로그에 비해 8 로그 10 CFU / 마우스를이었다 더 높은 세균 접종에 기인 할 수있다 <sub> 10 CFU /를 호중구 허벅지 (37)와 기관 내 삽관 (30) 모델 마우스입니다. 그것은 번역 예측 능력을 평가하기 위해 기존 모델과 임상 데이터와의 상관 관계와 직접 비교를 허용하는 이와 같은 데이터의 수집, 벤치마킹을 위해 중요하다. 기관 내 삽관 폐 감염 모델의 더 광범위한 사용은 분석의이 유형에 대한 추가 데이터를 제공 할 것입니다.
이 면역 폐렴 모델의 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 그것은 높은 세균 접종은 일반적으로 너무 심한 감염의 이러한 연구 결과를 필요하기 때문에 자연 저항의 출현을 평가하기에 매우 적합하지 않습니다. 시도에 이어 (파일 데이터) 기존의 독소를 제거하기 위해 접종의 철저한 세척에도 불구하고 (이하 24 시간에서 죽어가는이되고, 즉 동물) 박테리아 7 또는 8 로그, 빠른 사망률이 관찰되었다베이스 라인에서 10 CFU의 부담을 달성했다. 이것큰 설치류를 이용하여이 문제를 해결하는 것이 가능할 수있다. 쥐, 특히 무거운 쥐 (> 250g), 더 나은 마우스에 비해 높은 접종을 허용 할 것으로 보인다 및 연구의 이러한 유형에 적합 할 수있다. 병원체의 상호 작용 : 두 번째 제한은 감염 인핸서 한천의 사용은 특정 호스트의 평가 용 모델을 사용하는 것을 배제 할 수 있다는 것이다. 이는 감염이 완전히 폐 내에서 확립 될 때까지 한천 보호 초점을 제공하는 것으로 여겨진다. 오히려이 문제를 극복하기 위해 한천보다 식염수에 접종을 제공 할 수있다; 그러나, 이것은 일부 균주 감염을 생산할 것을 주목해야한다. 셋째, 기술에 능숙하게 할 필요 가파른 학습 곡선이있다. 절차는 특히 마우스의 섬세한 될 수 있습니다. 실수 식도로 금속 정맥을 배치 쉽고, 과도한 힘이 식도 또는 기관 중 하나의 구멍으로 이어질 수 있습니다. 접종주의 깊게 배치는도필요한 동물 중 하나를 적절하게 감염 복구하거나하지 않을 수 있습니다. 원활하고 정확하게, 그러나 인내와 인내로, 하나는 매우 능숙하게 할 수 있고 신속하게 기술을 수행합니다.
호중구에 대한 요구를 제거 안정성 및 재현성을 향상 연구자 개 병원체 균주를 연구 할 수 있도록 실험 설계의 유연성을 개선하고 폐렴의 약물 동력학을 특성화 도전 감염을 제공함으로써, 이러한 면역 폐 감염 모델은 항생제 발견 상당한 가치를 추가 커뮤니티. 추가 연구자에 의해이 모델의 사용 증가는 더 광범위한 수용을 확보하고 적절한 해석을위한 지원 정보를 계속 제공하기 위해 필요한 벤치마킹을 제공하는 데 도움이됩니다.
The authors have nothing to disclose.
JH 인정하고 먼저 우리에게이 모델을 가르치는 스승, 친구와 전 매니저 발레리 베리 감사하고자; 우리에게의 기초를 가르치고 항균 PK의 / (PD)의 필드에 우리의 노력을 영감 게리 Woodnutt. 모든 저자는 우리의 과학에 대한지지 및 감사에 대한 데이비드 페인을 감사드립니다. 우리는 이러한 방법, 특히 피트 DeMarsh, 롭 스트라우브, 로니 페이지와 그러 겠지 시몬를 사용하여 생성 된 데이터의 몸에 기여 생체 내 미생물 동료에서 우리의 이전을 인정하고 싶습니다. 마지막으로, 우리의 감사는 특히 우리가 요청하는 모든 마이크를 (린 맥 클로 스키, 조쉬 웨스트와 샤론 분)을 제공하기 위해, 그들의 도움을 우리의 체외 미생물학 동료로 이동; 및 전문가의 조언 및 지원 (린다 밀러, 니콜 Scangarella – 오만, 데보라 버틀러)를 제공하는 임상 미생물학 팀.
TSA II Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | Becton Dickinson and Company | 4321261 | |
Chocolate II Agar | Becton Dickinson and Company | 4321267 | |
BBL Brain Heart Infusion Broth Modified | Becton Dickinson and Company | 299070 | |
BBL Trypticase Soy Broth with 20% Glycerol | Becton Dickinson and Company | 297808 | storage media for frozen stock |
Inoculating loop | Nunc | 251586 | |
0.9% Sodium Chloride, USP | Baxter Healthcare Corporation | NDC 0338-0048-04 | |
Difco Nutrient Agar | Becton Dickinson and Company | 213000 | |
30 ml free standing centrifuge tube with cap | EverGreen Scientific | 222-3530-G80 | |
50 ml Polypropylene Conical Tube 30 x115mm | Falcon, a Corning Brand | 352070 | |
14 ml Polypropylene Round-Bottom Tube 17 x 100mm | Falcon, a Corning Brand | 352059 | |
Guide Tool | Intek Services Ltd | GT01 | custom-made metal cannula for rats |
90' Portex tubing | SAI | POR-080-100 | plastic cannula for rats |
1 ml TB syringe slip tip | Becton Dickinson and Company | 309659 | |
PrecisionGlide Needle 25G x 5/8 | Becton Dickinson and Company | 305122 | |
Animal feeding needle – straight 20×3" 2-1/4 | Popper and Sons, Inc | 7903 | used to create metal cannula for mice |
Intramedic polyethylene tubing | Clay Adams brand – Becton Dickinson and Company | 427401 | plastic cannula for mouse |
75 TN 5.0ul syringe 26s/2"/2 | Hamilton | 87930 | HPLC glass injection syringe |
Pyrex tube, culture 25×150 screwcap with rubber liner | Corning | 9825-25 | to autoclave/store metal cannulae |
70% isopropyl alcohol | Vi-Jon (Swan) | NDC 0869-0810-43 | |
Isoflurane, USP | Piramal Healthcare | NDC 66794-013-10 | |
Stomacher | Seward | Stomacher80 | |
Stomacher 80 classic bags | Seward | BA6040 | |
Assay plate, 96 well, round bottom | Costar, Corning Inc | 3795 | optional, for serial diluting |
Blood Omni Plates | Hardy | #A127 | optional, rectangular blood plates |