МикроРНК основе Регулирование пикорнавирусы тропизм

Summary

We describe here a method for regulating picornavirus tropism by incorporating sequences complementary to specific microRNAs into the viral genome. This protocol can be adapted to all different classes of viruses with modifications based upon the length and nature of their life cycle.

Abstract

Cell-specific restriction of viral replication without concomitant attenuation can benefit vaccine development, gene therapy, oncolytic virotherapy, and understanding the biological properties of viruses. There are several mechanisms for regulating viral tropism, however they tend to be virus class specific and many result in virus attenuation. Additionally, many viruses, including picornaviruses, exhibit size constraints that do not allow for incorporation of large amounts of foreign genetic material required for some targeting methods. MicroRNAs are short, non-coding RNAs that regulate gene expression in eukaryotic cells by binding complementary target sequences in messenger RNAs, preventing their translation or accelerating their degradation. Different cells exhibit distinct microRNA signatures and many microRNAs serve as biomarkers. These differential expression patterns can be exploited for restricting gene expression in cells that express specific microRNAs while maintaining expression in cells that do not. In regards to regulating viral tropism, sequences complementary to specific microRNAs are incorporated into the viral genome, generally in the 3′ non-coding regions, targeting them for destruction in the presence of the cognate microRNAs thus preventing viral gene expression and/or replication. MicroRNA-targeting is a technique that theoretically can be applied to all viral vectors without altering the potency of the virus in the absence of the corresponding microRNAs. Here we describe experimental methods associated with generating a microRNA-targeted picornavirus and evaluating the efficacy and specificity of that targeting in vitro. This protocol is designed for a rapidly replicating virus with a lytic replication cycle, however, modification of the time points analyzed and the specific virus titration readouts used will aid in the adaptation of this protocol to many different viruses.

Introduction

Развитие широко применимо, простой и эффективный метод для проектирования вектор с ограниченной тропности обеспечивает большие возможности для повышения безопасности, биологическое понимание и терапевтическое применение вирусов. Некоторые механизмы существуют целевой вирусный тропизм включая transductional транскрипционные и трансляционные методов на основе. Тем не менее, эти способы не подходят и для других векторных систем, могут потребовать дефектные сигнальных путей в клетках-мишенях или необходимо введение больших последовательностей, кодирующих в вирусный геном. Кроме того, эти способы могут привести к ослаблению вируса, значительно затрудняет их терапевтическую активность и ограничивает понимание немодифицированной системы.

MicroRNAs небольшие (22-25 нуклеотидов), некодирующие РНК, переносчики генов глушителей в эукариотических клетках. Функция MicroRNAs путем связывания комплементарных последовательностей-мишеней (элементы ответа) в мессенджере РНК (мРНК) resulti нг в транскриптов дестабилизации, деградации или трансляционной репрессии. MicroRNAs обычно связывают элементы отклика с частичной комплементарности и дают небольшие изменения в экспрессии генов , ^{1, 2, 3, 4, 5.} Более существенные изменения в экспрессии генов может быть достигнуто путем увеличения комплементарность элемента отклика ^6. Тысячи зрелых микроРНК были идентифицированы в различных видов и многих моделей демонстрируют дифференциальная экспрессия в различных клеточных и тканевых типов ^{7, 8, 9.} Эти сигнатуры микроРНК могут быть использованы для клеток конкретного ограничения амплификации вируса путем включения дополнительных элементов идеально отклика в вирусный геном ^10,= "Xref"> ^{11, 12, 13.} Общая цель этой микроРНК-таргетинга техники является контроль тропизм векторного генома без дополнительного ослабления.

Полезность этого метода для регулирования вирусную тропизм первоначально был продемонстрирован в лентивирусов векторов , чтобы ограничить экспрессию трансгена в конкретных тканях ^{14, 15, 16.} Этот метод впоследствии был применен к широкому спектру репликации и не репликации вирусных векторов для усиления генной терапии, а также улучшить профили безопасности многих онколитических вирусов за счет устранения нежелательных токсичностью в нормальных тканях ^{10, 11, 12, 13, 17} , Он также используется для обеспечения безопасного и еffective живых ослабленных вакцин, а также для улучшения вируса и производства вакцины процессов ^{18, 19, 20, 21.} МикроРНК-ориентации вектора может позволить затухания в вакцинированных хостов или целевых систем при сохранении уровней роста дикого типа в системах производителей. МикроРНК-нацеливание также могут быть использованы для улучшения биологической безопасности вирусов для исследовательских целей путем ограничения передачи у одного вида (например , человека), сохраняя при этом передачу в других хостов ^22. И, наконец, микроРНК-таргетинг может позволить глубокий анализ вирусных жизненных циклов и конкретных ролей типов клеток в патогенезе и иммунитета путем выделения вируса рост ^{23, 24, 25, 26.}

Этот метод предлагает альтernative метод, который легко реализуется и применяется таргетинг для всех вирусных систем. Кроме того, постоянно расширяющийся набор зрелых микроРНК с помощью дифференциальных паттернов экспрессии в конкретных типах клеток делает этот метод очень универсальный. МикроРНК основе нацеливание доказала эффективными для различных вирусных систем без ущерба для системной функции. Основные ограничения этого метода включают в себя метод проб и ошибок, оптимизация потенциал для эвакуации мутаций, а также потенциальные эффекты вне цели на эндогенных транскриптов. Тем не менее, эти ограничения как правило, могут быть преодолены с оптимизированным и рациональной конструкции элемента ответа. РНК-вирусы Положительно чувство, как правило, особенно реагирует на микроРНК-ориентации в связи с ориентацией положительным смысле их генома и наличие транскриптов к микроРНК машин во время полного цитоплазматической цикла репликации. Здесь мы опишем протокол для генерации микроРНК-мишенью Пикорнавирус и experimСИХИЧЕСКОЕ методы для проверки эффективности и специфичности , что адресность в лабораторных условиях .

Protocol

1. Элементы Клонирование микроРНК Ответ в вирусный геном Конструкция микроРНК элемент ответа вставки. Определить нужный микроРНК и соответствующей последовательности-мишени. Несколько баз данных, доступных со зрелыми последовательностей микроРНК. Рекомендовано: …

Representative Results

В таблице 1 представлены результаты , типичные для анализа для титрования в пикорнавирусами и описывает , как вычислить 50% тканевой культуры инфекционную дозу. Схематическое представление общей концепции микроРНК основе регуляции вирусной тропизм , описанно…

Discussion

Конструкция, состав и локализация элементов отклика микроРНК внутри вирусного генома будет диктовать нацеливание эффективность и специфичность. Оптимизация этих потребует метода проб и ошибок. Тем не менее, рациональный дизайн на основе РНК – структурного анализа и предыдущих исслед…

Materials

RE encoding Oligonucleotides	IDT	PAGE-Purified Ultramer	Sequence Designed by Investigator
Oligonucleotides encoding unique restriction site	IDT	25nM	Sequence Designed by Investigator
Expand High Fidelity PCR Kit	Sigma Aldrich	11732641001	Many other High Fidelity Polymerase PCR kits available
T4 DNA Ligase System	NEB	M0202S
MEGAscript Kit	ThermoFisher Scientific	AM1333
MEGAclear Kit	ThermoFisher Scientific	AM1908
0.5 M EDTA	ThermoFisher Scientific	AM9260G	RNase-free
5 M NH4 Acetate	ThermoFisher Scientific	N/A	Comes in MEGAclear Kit
Ethanol	ThermoFisher Scientific	BP2818100
Nuclease-free Water	Fisher Scientific	AM9938
TransIT-2020 Transfection Reagent	Mirus	MIR 5404
TransIT-mRNA Transfection Reagent	Mirus	MIR 2225
0.2 μm syringe filter	Millipore	SLGP033RS
2mL Screw-Cap Tubes	Sarstedt	72.694.005
Cell Scrapers	Fisher Scientific	08-100-241
MicroRNA Mimics	Dharmacon	Varied
MTT Cell Proliferation Assay	ATCC	30-1010K
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells	ThermoFisher Scientific	18265017
pBlueScript II Vectors	Agilent Technologies	Variable (e.g. 212205)	There are different plasmids with T7 or T3 promoters and variable cloning sites to enable cloning and RNA transcription.