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Summary
Abstract
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Protocol
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Immunology and Infection

피 코르 나 바이러스과의 바이러스 친 화성의 마이크로 RNA-기반 규제

Published: February 06, 2017
doi:
10.3791/55033
,
1Department of Molecular Medicine,Mayo Clinic College of Medicine

Summary

We describe here a method for regulating picornavirus tropism by incorporating sequences complementary to specific microRNAs into the viral genome. This protocol can be adapted to all different classes of viruses with modifications based upon the length and nature of their life cycle.

Abstract

Cell-specific restriction of viral replication without concomitant attenuation can benefit vaccine development, gene therapy, oncolytic virotherapy, and understanding the biological properties of viruses. There are several mechanisms for regulating viral tropism, however they tend to be virus class specific and many result in virus attenuation. Additionally, many viruses, including picornaviruses, exhibit size constraints that do not allow for incorporation of large amounts of foreign genetic material required for some targeting methods. MicroRNAs are short, non-coding RNAs that regulate gene expression in eukaryotic cells by binding complementary target sequences in messenger RNAs, preventing their translation or accelerating their degradation. Different cells exhibit distinct microRNA signatures and many microRNAs serve as biomarkers. These differential expression patterns can be exploited for restricting gene expression in cells that express specific microRNAs while maintaining expression in cells that do not. In regards to regulating viral tropism, sequences complementary to specific microRNAs are incorporated into the viral genome, generally in the 3′ non-coding regions, targeting them for destruction in the presence of the cognate microRNAs thus preventing viral gene expression and/or replication. MicroRNA-targeting is a technique that theoretically can be applied to all viral vectors without altering the potency of the virus in the absence of the corresponding microRNAs. Here we describe experimental methods associated with generating a microRNA-targeted picornavirus and evaluating the efficacy and specificity of that targeting in vitro. This protocol is designed for a rapidly replicating virus with a lytic replication cycle, however, modification of the time points analyzed and the specific virus titration readouts used will aid in the adaptation of this protocol to many different viruses.

Introduction

제한된 친 화성을 가진 벡터 엔지니어링에 대해 광범위하게 적용 할 수있는 간단하고 효과적인 방법의 개발은 안전성, 생물학적 이해와 바이러스의 치료 유틸리티를 향상시키는 중요한 기회를 제공한다. 여러 가지 메커니즘은 transductional, 전사 및 번역 기반 기술을 포함하여 바이러스 친 화성을 대상으로 존재한다. 그러나 이러한 방법은 표적 세포에 결함 신호 전달 경로가 필요하거나 바이러스 게놈에 큰 코딩 서열의 삽입을 요구할 수있다, 모든 벡터 시스템에 일반적으로 적용되지 않습니다. 또한 이러한 방법은 크게 자신의 치료 활동을 방해하고 수정되지 않은 시스템에 대한 통찰력을 제한, 바이러스의 감쇠가 발생할 수 있습니다.

마이크로 RNA는 진핵 세포의 유전자 침묵을 매개 비 코딩 RNA를 작은 (22 ~ 25 뉴클레오티드)이다. (mRNA의) resulti 메신저 RNA를 보완 대상 시퀀스 (응답 요소)를 결합하여 마이크로 RNA 기능 성적 증명서의 불안정, 저하 또는 번역 억압에서 NG. 마이크로 RNA는 일반적으로 부분적으로 상보성 응답 요소를 결합하여 유전자 발현을 1, 2, 3, 4, 5의 작은 변형을 얻었다. 유전자 발현의 더 중요한 변화는 반응 요소 (6)의 보완을 증가시킴으로써 달성 될 수있다. 성숙 마이크로 RNA 수천 세포 및 조직 유형 7, 8, 9의 다양한 종 많은 전시 차등 발현 양상의 다양한 확인되었다. 이러한 마이크로 RNA 서명은 바이러스 게놈 (10)에 완벽하게 상보 응답 요소를 도입하여 바이러스 증폭 셀 고유의 제한을 위해 이용 될 수있다= "외부 참조"> 11, 12, 13. 이 마이크로 RNA-타겟팅 기술의 전체 목표는 추가적인 감쇠없이 벡터 게놈의 친 화성을 제어 할 수있다.

바이러스의 친 화성을 조정하기위한이 방법의 유용성은 원래 특정 조직 14, 15, 16에서 유전자 발현을 제한하는 렌티 바이러스 벡터의 입증되었다. 이 기술은 계속해서,도 17를 복제 정상 조직 10, 11, 12, 13, 원하지 않는 부작용을 제거하여 다수의 온 콜리 틱 바이러스의 안전성 프로파일을 개선 할뿐만 아니라 개선 된 유전자 치료를위한 바이러스 벡터 비 복제의 광대 한 배열에 적용된 . 또한, 안전하고 전자를 생성하기 위해 이용 된ffective 생균 백신과 바이러스 백신 제조는 18, 19, 20, 21를 처리 향상시킬 수있다. 제조자 시스템에서 야생형 성장 수준을 유지하면서, 마이크로 RNA-타겟팅 벡터 접종 호스트 또는 타겟 시스템의 감쇠를 허용 할 수있다. 마이크로 RNA-타겟팅도 다른 호스트 (22) 내의 전송을 유지하면서, 하나의 종 (예 : 인간)에 송신을 제한함으로써 연구 목적을위한 바이러스의 생물 안전성을 향상 시키는데 사용될 수있다. 최종적으로 심층 바이러스 성장 23, 24, 25, 26을 분리하는함으로써 바이러스 생활주기와 병원성 및 면역 세포 유형의 특정 역할을 분석 할 수 있도록 마이크로 RNA는 타겟팅.

이 기술은 고도을 제공합니다모든 바이러스 시스템에서 쉽게 구현 방법 및 적용 타겟팅 ernative. 또한, 특정 세포 유형에 차등 발현 패턴을 가진 성숙한 마이크로 RNA의 끊임없이 확장 컬렉션이 기술은 매우 다양한 있습니다. 마이크로 RNA-기반 타겟팅 시스템의 기능을 손상시키지 않으면 서 바이러스 시스템의 다양한 효능이 입증되었다. 이 기술의 주요 제한은 시행 착오 최적화, 탈출 돌연변이의 가능성, 그리고 내생 성적 증명서에 잠재적 인 오프 대상 효과를 포함한다. 그러나, 이러한 제한은 일반적으로 최적화 합리적인 반응 요소 디자인 극복 될 수있다. 포지티브 – 센스 RNA 바이러스는 그들의 게놈의 포지티브 – 센스 방향과 완전히 세포질 복제 사이클 동안 마이크로 RNA 기계에 사체의 가용성에 마이크로 RNA-타겟팅 특히 반응 경향이있다. 여기서 우리는 마이크로 RNA-대상으로 피 코르 나 바이러스과의 바이러스와 experim를 생성하기위한 프로토콜을 설명ental 방법은 시험관 타겟팅의 효율성과 특이성을 확인합니다.

Protocol

바이러스 게놈에 1. 복제 마이크로 RNA 응답 요소 디자인 마이크로 RNA 반응 요소 삽입. 원하는 마이크로 RNA와 해당 표적 서열을 확인합니다. 여러 데이터베이스는 성숙한 마이크로 RNA 서열 사용할 수 있습니다. 대상 : http://www.mirbase.org/ 9, 27, 28, 29, 30.</su…

Representative Results

표 1은 피 코르 나 바이러스과의 바이러스에 대한 적정 분석의 전형적인 결과를 나타내고, 50 % 조직 배양 감염 용량을 계산하는 방법을 설명한다. 이 논문에 기재된 바이러스 향성의 마이크로 RNA 기반 규제의 전반적인 개념의 개략도는 세포 내 작용 어닐링 플라스미드 삽입 반응 요소 올리고 뉴클레오티드의 적절한 설계 동안 반응 요소에도 1의 ?…

Discussion

디자인, 조성 및 바이러스 게놈 내에서 마이크로 RNA 응답 요소의 현지화 효능과 특이성을 대상으로 지시합니다. 이러한 최적화 시행 착오가 필요합니다. 그러나, 합리적인 디자인 RNA 구조 분석 및 최적화 최소한 10, 11, 12, 13, 38과 함께이 기술의 구현에서 바이러스 복제 및 마…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Al and Mary Agnes McQuinn, the Richard M. Schulze Foundation, and an NIH Relief Grant from the Mayo Clinic funded representative work described here.

Materials

RE encoding Oligonucleotides IDT PAGE-Purified Ultramer Sequence Designed by Investigator
Oligonucleotides encoding unique restriction site IDT 25nM Sequence Designed by Investigator
Expand High Fidelity PCR Kit Sigma Aldrich 11732641001 Many other High Fidelity Polymerase PCR kits available
T4 DNA Ligase System NEB M0202S
MEGAscript Kit ThermoFisher Scientific AM1333
MEGAclear Kit ThermoFisher Scientific AM1908
0.5 M EDTA ThermoFisher Scientific AM9260G RNase-free
5 M NH4 Acetate ThermoFisher Scientific N/A Comes in MEGAclear Kit
Ethanol ThermoFisher Scientific BP2818100
Nuclease-free Water Fisher Scientific AM9938
TransIT-2020 Transfection Reagent Mirus MIR 5404
TransIT-mRNA Transfection Reagent Mirus MIR 2225
0.2 μm syringe filter Millipore SLGP033RS
2mL Screw-Cap Tubes Sarstedt 72.694.005
Cell Scrapers Fisher Scientific 08-100-241
MicroRNA Mimics Dharmacon Varied
MTT Cell Proliferation Assay ATCC 30-1010K
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells ThermoFisher Scientific 18265017
pBlueScript II Vectors Agilent Technologies Variable (e.g. 212205) There are different plasmids with T7 or T3 promoters and variable cloning sites to enable cloning and RNA transcription.
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