Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between the T-cell receptor and tumor antigens, presented by human leukocyte antigens, governs T-cell functionality; these methods include protein production, X-ray crystallography, biophysics, and functional T-cell experiments.
Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell surface-expressed T-cell receptor (TCR) must functionally recognize human leukocyte antigen (HLA)-restricted tumor-derived peptides (pHLA). However, we and others have shown that most TCRs bind sub-optimally to tumor antigens. Uncovering the molecular mechanisms that define this poor recognition could aid in the development of new targeted therapies that circumnavigate these shortcomings. Indeed, present therapies that lack this molecular understanding have not been universally effective. Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between TCRs and pHLA governs T-cell functionality. These methods include the generation of soluble TCRs and pHLA and the use of these reagents for X-ray crystallography, biophysical analysis, and antigen-specific T-cell staining with pHLA multimers. Using these approaches and guided by structural analysis, it is possible to modify the interaction between TCRs and pHLA and to then test how these modifications impact T-cell antigen recognition. These findings have already helped to clarify the mechanism of T-cell recognition of a number of cancer antigens and could direct the development of altered peptides and modified TCRs for new cancer therapies.
Рентгеновской кристаллографии было и будет по-прежнему, чрезвычайно мощная техника, чтобы понять природу лиганд-рецепторных взаимодействий. Визуализируя этих взаимодействий в атомном деталях, не только возможно, чтобы раскрывать молекулярные механизмы, регулирующие многие биологические процессы, но также можно непосредственно изменять контактные интерфейсы для терапевтического эффекта. В сочетании с методами, такими как поверхностного плазмонного резонанса и изотермические титрование калориметрии (назвать только пару), такие изменения могут быть проанализированы биофизически оценить непосредственное влияние на аффинность связывания, кинетики взаимодействия и термодинамики. Наконец, выполняя функциональные эксперименты на соответствующих типах клеток, детальная картина молекулярного и функционального воздействия модификаций взаимодействий рецептор-лиганд, можно почерпнуть, обеспечивая очень специфическую механистическую информацию. В целом, эти типы методов обеспечивают атомное разрешение изображения, что позволяло бы сдерживать mination как биологические системы работают, с соответствующими последствиями для сопутствующих диагностических и терапевтических достижений.
Наша лаборатория регулярно использует эти методы для изучения рецепторов, которые обеспечивают иммунитет человека Т-клеток к патогенам и рака, в аутоиммунитета, и во время трансплантации. Здесь, мы обратили внимание на человека CD8 + Т-клеточного ответа к раку, опосредованного взаимодействия между Т-клеточного рецептора (TCR) и антиген лейкоцитов человека (HLA) -ограниченных опухолей , полученных пептидов (pHLA). Это важно , поскольку, несмотря на то CD8 + Т – клетки способны раковыми клетками – мишенями, мы и другие ранее показали , что противораковые ТКР неоптимально связываются с их родственными pHLA 1, 2. Таким образом, многие лаборатории попытались изменить либо ТКС 3, 4, 5 или пептидный лиганд , 6,класс = "Xref"> 7, 8 с целью повышения иммуногенности и лучше раковых клеток – мишеней. Тем не менее, эти подходы не всегда эффективны и могут иметь серьезные побочные эффекты, в том числе и от ворот токсичностью 4, 9, 10. Дальнейшие исследования изучения молекулярных механизмов, которые регулируют Т-клеточного распознавания раковых антигенов будет иметь жизненно важное значение для преодоления этих недостатков.
В настоящем исследовании мы сосредоточились на ответах против аутологичных клеток меланомы по CD8 + Т – клеток , специфичных для фрагмента антигена дифференцировки меланоцитов гликопротеина 100 (gp100), gp100 280-288, представленные HLA-A * 0201 (наиболее часто -expressed человек pHLA класс I). Этот антиген был широко изучен мишенью для иммунотерапии меланомы и был разработан в качестве так называемого "гетероклитический" пептид, в котором валин замещает аланинна якорной позиции 9 для повышения стабильности pHLA 11. Этот подход был использован для усиления индукции меланомой-реактивный ЦТК в пробирке и успешно используется в клинических испытаниях 12. Тем не менее, изменения в пептидных остатков может иметь непредсказуемое воздействие на Т-клеточной специфичности, о чем свидетельствует плохой эффективности большинства heterolitic пептидов в клинике 6, 13. Действительно, еще одна гетероклитический форма gp100 280-288, в котором пептидный остаток Glu 3 был заменен на Ala, аннулировал признание поликлональной популяции gp100 280-288 Определённые Т – клеток 14, 15. Ранее мы показали , что даже незначительные изменения в пептидный якорных остатков может существенно изменить распознавание Т-клеток непредсказуемым образом 6, 16. Таким образом, исследование было сосредоточено на сборкеING более детальную картину того , как CD8 + Т – клетки распознают gp100 и как модификации взаимодействия ТКО и pHLA может повлиять на эту функцию.
Здесь, мы сгенерировали с высокой степенью чистоты, растворимые формы двух ТКР специфических для gp100 280-288 , представленный HLA-A * 0201 (А2-YLE), а также природные и измененные формы pHLA. Эти реагенты были использованы для создания кристаллов протеина решить тройную атомную структуру человеческого TCR в комплексе с гетероклитический форме А2-YLE, а также двух мутантных pHLAs в unligated форме. Затем мы использовали сканирующий подход пептида, чтобы продемонстрировать влияние пептидных замен на ТКР путем проведения углубленного биофизических экспериментов. И, наконец, мы получили генетически модифицированную CD8 + линии Т-клеток, перепрограммирован, чтобы выразить один из А2-YLE конкретных ТКР, для выполнения функциональных экспериментов для определения биологической воздействия различных пептидных модификаций. Эти данные свидетельствуют о том, что даже Модиленностью к пептидным остатков, которые находятся за пределами связывания мотива TCR может иметь непредсказуемый эффект домино на соседних пептидных остатков, которые отменяют TCR связывания и распознавания Т-клеток. Наши результаты представляют собой первый пример структурных механизмов, лежащих в основе Т-клеточного распознавания этой важной терапевтической мишенью для меланому.
Протоколы, описанные здесь, обеспечивают основу для молекулярного и клеточного рассечения Т-клеточных реакций в контексте любого заболевания человека. Хотя рак был главным предметом данного исследования, мы использовали очень схожие подходы для исследования Т-клеточного ответа на вирусы 32, 33, 34, 35, 36, 37 и 38 во время аутоиммунитете, 39, 40. Кроме того, мы использовали эти методы в более широком смысле , чтобы понять молекулярные принципы , которые регулируют признание Т-клеточный антиген 2, 19, 41, 42. Действительно, непредсказуемый характер изменений к пептидным остатков, даже те,Внешняя часть контактных остатков TCR, распознавание воздействия Т-клеток имеет важное значение для проектирования гетероклитический пептидов. Эти данные непосредственно способствовали разработке новых Т-клеточной терапии, в том числе пептидных вакцин 6, 43 и искусственных высоким сродством ТКР 3, 4, 5, 20, 44, а также усиленных диагностики 45, 46, 47.
Критические шаги в рамках протокола
Поколение с высокой степенью чистоты, функционального белка имеет важное значение для всех методов, описанных в этой статье.
Модификации и устранение неисправностей
Трудности в создании высокочистого белка часто относятся к выражению высоко- чистой, нерастворимый IBs из системы экспрессии палочки E.. Как правило, изменение протокола экспрессии (например, побуждая при различных оптических плотностей, с использованием различных штаммов E.coli, или с использованием различных образований средств массовой информации) решает эти вопросы.
Ограничения метода
Эти методы используют растворимые белковые молекулы (TCR и pHLA), которые обычно представлены на поверхности клеток. Таким образом, важно обеспечить, чтобы структурные / биофизические данные согласуются с результатами клеточных подходов к подтверждающими биологическое значение.
Значение метода в отношении существующих / альтернативных методов
Благодаря использованию рентгеновской кристаллографии и биофизики обосновываться путем функционального анализа, мы и другие показали , что ТКО специфичные для рака эпитопы , как правило , характеризуются низкой аффинностью связывания 48. Такое низкое сродство TCR может помочь объяснить, почему Т-клетки аре, естественно, не эффективны при очистке рака. С высокой разрешающей способностью атомных структур комплексов между противораковыми ТКР и родственными опухолевых антигенов начинают выявить молекулярную основу этого слабого сродства. Кроме того, эти исследования полезны для определения механизмов, лежащих в основе терапевтических вмешательств , направленных на преодоление этой проблемы, высева будущих улучшений 16. В данном исследовании мы рассмотрели первую структуру природной αβTCR в комплексе с gp100 HLA-A * 0201-ограниченной меланомой эпитопов. Структура, в сочетании с биофизической детальным осмотром, показал общий режим связывания взаимодействия. Мы также обнаружили неожиданный молекулярный переключатель, который произошел в мутантной форме пептида, который аннулировал TCR связывания (оцениваемые с использованием поверхностного плазмонного резонанса) и CD8 Т-клеточного распознавания + (функциональные эксперименты). Это было возможно только продемонстрировать этот новый механизм HLA антигена presentatiна использовании методов высокого разрешения, описанных.
Будущие приложения или направления после освоения этой техники
В целом, полученные нами результаты показывают, мощность рентгеновской кристаллографии и биофизических методов в сочетании с надежными функционального анализа. С помощью этих подходов, можно рассекать из точных молекулярных механизмов, которые регулируют распознавание антигена Т-клеток. В самом деле, можно также использовать этот подход для решения структуры unligated ТКР, демонстрируя , как конформационные изменения могут играть определенную роль в процессе антигена дискриминации 49, 50, 51. Лучшее понимание весьма сложной и динамичной природы, лежащей в основе TCR-pHLA взаимодействий также имеет очевидные последствия для дизайна терапии. Будучи в состоянии непосредственно "видеть" молекулы, которые в настоящее время терапевтически целевых, а также к тому, что модификации на антиген recognitioп, будет явно улучшить развитие этих лекарственных средств в будущем. В этом исследовании мы показали, что даже изменения в одном пептидный остаток, который не сильно зацепляется TCR может непредсказуемо передавать структурные изменения в других остатков в HLA-пептид, связанный, который, в свою очередь, приводит к изменению резко Т-клеточного распознавания. Более полное понимание молекулярных механизмов, используемых в процессе распознавания антигена Т-клеток будет чрезвычайно полезным при разработке будущих методов лечения для широкого спектра заболеваний человека.
The authors have nothing to disclose.
BM поддерживается студенчества Cancer Research UK PhD. AG поддерживается студенчества Life Science Research Network Уэльс PhD. VB поддерживается студенчества Cancer Research Wales PhD. DKC является Wellcome Trust Исследование развития карьеры сотрудник (WT095767). АКС является Wellcome Trust Следователь. ГХМ финансируется за счет совместной Life Science Research Network Уэльского и Tenovus рака Care PhD студенчества. Мы благодарим сотрудников по алмазам Источник света для обеспечения удобства и поддержки.
S.O.C. media | Invitrogen |
Orbi-Safe New Orbit incubator | Sanyo |
carbenicillin | Sigma |
IPTG | Fisher |
Quick Coomassie Stain SafeStain | Generon |
Legend RT centrifuge | Sorvall |
Tris | Fisher |
magnesium chloride | Arcos |
NaCl | Fisher |
glycerol | Sigma-Aldrich |
Sonopuls HD 2070 | Bandelin |
DNAse | Fisher |
Triton | Sigma-Aldrich |
EDTA | Fisher |
guanidine | Fisher |
NanoDrop ND1000 | Thermo |
Peptides | Peptide Protein Research |
dithiothreitol | Sigma-Aldrich |
L-arginine | SAFC |
cysteamine | Fisher |
cystamine | Fisher |
dialysis tubing | Sigma-Aldrich |
urea | Sigma-Aldrich |
Metricel 0.45 μm membrane filter | Pall |
POROS 10/100 HQ | Applied biosystems |
ÄKTA pure FPLC system | GE Healthcare Life Sciences |
10 kDa MWCO Vivaspin 20 | Sartorius |
10 kDa MWCO Vivaspin 4 | Sartorius |
Superdex 200 10/300 GL column | GE Healthcare Life Sciences |
Phosphate Buffer Saline | Oxoid |
BIAcore buffer HBS | GE Healthcare Life Sciences |
Biotinylation kit | Avidity |
BIAcore T200 | GE Healthcare Life Sciences |
CM5 chip coupling kit | GE Healthcare Life Sciences |
streptavidin | Sigma-Aldrich |
Microcal VP-ITC | GE Healthcare Life Sciences |
Hepes | Sigma-Aldrich |
Gryphon crystallisation robot | Art Robbins Instruments |
Intelli-plate | Art Robbins Instruments |
Crystallisation screens and reagents | Molecular Dimensions |
75 cm2 flask | Greiner Bio-One |
0.22 μm filters | Miller-GP, Millipore |
Ultra-Clear ultracentrifuge tube | Beckman Coulter |
Optima L-100 XP with SW28 rotor | Beckman Coulter |
CD8 microbeads | Miltenyi Biotec |
anti-CD3/CD28 Dynabeads | Invitrogen |
anti-PE microbeads | Miltenyi Biotec |
CK medium, PHA | Alere Ltd |
anti-TCRVβ mAb | BD |
dasatinib | Axon |
MIP-1β and TNFα ELISA | R&D Systems |
51Cr | PerkinElmer |
1450 Microbeta counter | PerkinElmer |