Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between the T-cell receptor and tumor antigens, presented by human leukocyte antigens, governs T-cell functionality; these methods include protein production, X-ray crystallography, biophysics, and functional T-cell experiments.
Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell surface-expressed T-cell receptor (TCR) must functionally recognize human leukocyte antigen (HLA)-restricted tumor-derived peptides (pHLA). However, we and others have shown that most TCRs bind sub-optimally to tumor antigens. Uncovering the molecular mechanisms that define this poor recognition could aid in the development of new targeted therapies that circumnavigate these shortcomings. Indeed, present therapies that lack this molecular understanding have not been universally effective. Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between TCRs and pHLA governs T-cell functionality. These methods include the generation of soluble TCRs and pHLA and the use of these reagents for X-ray crystallography, biophysical analysis, and antigen-specific T-cell staining with pHLA multimers. Using these approaches and guided by structural analysis, it is possible to modify the interaction between TCRs and pHLA and to then test how these modifications impact T-cell antigen recognition. These findings have already helped to clarify the mechanism of T-cell recognition of a number of cancer antigens and could direct the development of altered peptides and modified TCRs for new cancer therapies.
Röntgenkristallografie is en zal blijven, een zeer krachtige techniek om de aard van ligand-receptor interacties begrijpen. Door visualiseren deze interacties in atomic detail, niet alleen is het mogelijk om de moleculaire mechanismen van vele biologische processen verspreiden, maar het is ook mogelijk de contacten interfaces voor therapeutisch voordeel direct kan wijzigen. In combinatie met technieken zoals oppervlakte plasmon resonantie en isothermische titratie calorimetrie (om maar een paar), dergelijke modificaties kunnen vervolgens worden geanalyseerd om de biofysisch directe invloed op bindingsaffiniteit, interactie kinetiek en thermodynamica beoordelen. Tenslotte door het functioneel experimenten relevante celtypes, een gedetailleerd beeld van de moleculaire en functionele effecten van wijzigingen aan receptor-ligand interacties kunnen worden afgeleid, waardoor specifieke mechanistische informatie. Overall, dit soort werkwijzen atomaire resolutie beeld zodat het ontmoedigen ling van hoe biologische systemen werken, met bijbehorende gevolgen voor diagnostische en therapeutische vooruitgang.
Ons laboratorium gebruikt routinematig deze technieken de receptoren die menselijke T-cel immuniteit tegen pathogenen en kanker bemiddelen in auto-immuniteit bestuderen en tijdens transplantatie. Hier richten we ons op de humane CD8 + T-celreactie op kanker, gemedieerd door een interactie tussen de T-celreceptor (TCR) en humaan leukocyt antigeen (HLA) -beperkte tumor afgeleide peptiden (Phla). Dit is belangrijk omdat, hoewel CD8 + T-cellen kunnen richten op kankercellen, hebben wij en anderen eerder aangetoond dat anti-kanker TCRs suboptimaal binden aan hun verwante Phla 1, 2. Zo hebben veel laboratoria geprobeerd wijziging in van de TCR 3, 4, 5 of peptide ligand 6,class = "xref"> 7, 8 om de immunogeniteit te verhogen en gerichter kankercellen. Maar deze benaderingen niet altijd effectief en kunnen ernstige bijwerkingen, zoals off-target toxiciteit 4, 9, 10 hebben. Verder onderzoek verkennen van de moleculaire mechanismen die T-cel herkenning van kanker antigenen regelen wezenlijk belang zijn voor deze tekortkomingen te overwinnen.
In deze studie hebben we ons gericht op de responsen tegen autologe melanoomcellen door CD8 + T-cellen specifiek voor een fragment van de melanocyt differentiatie antigeen glycoproteïne 100 (gp100), gp100 280-288, gepresenteerd door HLA-A * 0201 (de meest -expressed menselijk Phla klasse I). Dit antigen heeft een uitgebreid bestudeerd doelwit voor melanoom immuuntherapie geweest en is ontwikkeld als een zogenaamde "heteroclitic" peptide waarin een alanine vervangt valinevoor anker positie 9 tot Phla stabiliteit 11 te verbeteren. Deze aanpak werd toegepast om de inductie van melanoom-reactieve CTLs in vitro verhogen en is met succes gebruikt in klinische studies 12. Echter, wijzigingen peptide residuen kunnen onvoorspelbare effecten op T-cel specificiteit aangetoond door de slechte werkzaamheid van de meeste heterolitic peptiden in de kliniek 6, 13 hebben. Inderdaad, een heteroclitic vorm van gp100 280-288, waarin peptiderest Glu3 werd vervangen door Ala, opgeheven erkenning door een polyklonale populatie van 280-288 gp100-specifieke T-cellen 14, 15. We hebben eerder aangetoond dat zelfs kleine veranderingen in peptide ankerresten aanzienlijk kan veranderen T-cel herkenning op onvoorspelbare wijze 6, 16. Zo is de studie concentreerde zich op te bouwening een gedetailleerder beeld van hoe CD8 + T-cellen herkennen gp100 en hoe wijzigingen van de interactie tussen TCR en Phla zou deze functie beïnvloeden.
Hier genereerden wij zeer zuivere, oplosbare vormen van twee TCR specifiek voor gp100 280-288 door HLA-A * 0201 (A2-YLE), evenals natuurlijke en veranderde vormen van Phla. Deze reagentia werden gebruikt voor eiwitkristallen genereren om het ternaire atoomstructuur van een mens TCR in complex met de heteroclitic vorm van A2-YLE, en twee van de mutante pHLAs in geligeerde vorm. Vervolgens gebruikten een peptide scanning aanpak het effect van peptide substituenten aan TCR's tonen door het uitvoeren van een grondige biofysische experimenten. Tenslotte, genereerden we een genetisch gemodificeerde CD8 + T-cellijn, geherprogrammeerd één van de A2-YLE specifieke TCR's tot expressie, om functionele experimenten van de biologische effecten van de verschillende peptidemodificaties testen. Deze gegevens tonen aan dat zelfs Modicaties residuen die buiten de TCR bindende motief peptide kan onvoorspelbaar domino-effect op de aangrenzende peptide residuen die teniet TCR binden en T-cel herkenning te hebben. Onze bevindingen vormen het eerste voorbeeld van de structurele onderliggende mechanismen van T-cel herkenning van deze belangrijke therapeutische doel voor melanoma.
De hier geschetste protocollen bieden een kader voor de moleculaire en cellulaire ontleding van T-cel responsen in het kader van een ziekte bij de mens. Hoewel kanker was het doel van dit onderzoek hebben we zeer soortgelijke processen voor T-celreacties op virussen 32, 33, 34, 35, onderzoeken 36, 37 en bij auto-immuniteit 38, 39, 40. Verder hebben we deze technieken breder de moleculaire principes die T-cel antigen herkenning 2, 19, 41, 42 beheersen begrijpen. Inderdaad, de onvoorspelbaarheid van wijzigingen residuen peptide, zelfs diebuiten de van de TCR contactresten, impacts T-cel herkenning heeft belangrijke implicaties voor het ontwerp van heteroclitic peptiden. Deze bevindingen hebben rechtstreeks bijgedragen aan de ontwikkeling van nieuwe T-celtherapie, waaronder peptide vaccins 6, 43 en kunstmatig hoge affiniteit TCR's 3, 4, 5, 20, 44, alsmede verbeterde diagnostische 45, 46, 47.
Kritische stappen in het protocol
Het genereren van een zeer zuiver, functioneel eiwit essentieel voor al de in dit document aangegeven methoden.
Wijzigingen en het oplossen van problemen
Moeilijkheden bij het genereren van zeer zuivere eiwitten hebben vaak betrekking op de expressie van zeer-Pure, onoplosbare IB van de E. coli expressiesysteem. Gewoonlijk modificeren van de expressie protocol (bijvoorbeeld het induceren van verschillende optische dichtheden, met verschillende E. coli-stammen, of verschillende media formaties) lost deze problemen.
Beperkingen van de techniek
Deze technieken oplosbare eiwitmoleculen (TCR en Phla) die normaal tot expressie worden gebracht op het celoppervlak. Aldus is het belangrijk dat structurele / biofysische bevindingen komen overeen met cellulaire benaderingen biologische betekenis bevestigen.
Betekenis van de techniek met betrekking tot bestaande / alternatieve methoden
Met behulp van röntgenkristallografie en biofysica onderbouwd door de functionele analyse hebben wij en anderen aangetoond dat TCR specifiek zijn voor kanker epitopen algemeen gekenmerkt door lage bindingsaffiniteiten 48. Deze lage TCR affiniteit kan helpen verklaren waarom T-cellen are nature niet effectief in clearing kanker. Hoge-resolutie atoomstructuren van complexen tussen anti-kanker TCRs en verwante tumorantigenen beginnen de moleculaire basis voor deze zwakke affiniteit tonen. Bovendien zijn deze studies zijn nuttig voor het bepalen van de mechanismen die de therapeutische interventies om dit probleem te overwinnen grondslag liggen, zaaien toekomstige verbeteringen 16. In dit onderzoek onderzochten we de eerste structuur van een natuurlijk voorkomend αβTCR in complex met een gp100 HLA-A * 0201-beperkte epitoop melanoom. De structuur, in combinatie met een diepgaand biofysische onderzoek bleek de totale bindingsmodus van de interactie. Wij ontdekt ook een onverwachte moleculaire schakelaar, die zich in een gemuteerde vorm van het peptide, dat ingetrokken TCR binding (bepaald met oppervlakte plasmon resonantie) en CD8 + T-cel herkenning (functionele experimenten). Was het alleen mogelijk om dit nieuwe mechanisme van HLA antigen Presentat tonenover het gebruik van hoge-resolutie methoden beschreven.
Toekomstige toepassingen of aanwijzingen na het beheersen van deze techniek
Overall, onze resultaten tonen het vermogen van röntgenkristallografie en biofysische werkwijzen in combinatie met krachtige functionele analyses. Met behulp van deze benaderingen kan men ontleden precieze moleculaire mechanismen die T-cel antigen herkenning regelen. Inderdaad is het ook mogelijk om deze benadering te gebruiken om de structuur van geligeerde TCRs lossen, zien hoe conformatieveranderingen een rol kan spelen tijdens antigen discriminatie 49, 50, 51. Een beter begrip van de zeer complexe en dynamische karakter dat TCR-Phla interacties ten grondslag ligt heeft ook duidelijke implicaties voor therapie design. In staat zijn om direct te 'zien' de moleculen die worden therapeutisch gericht zijn, evenals het effect dat wijzigingen hebben op antigen recognition, zal duidelijk verbeteren van de ontwikkeling van deze geneesmiddelen voor de toekomst. In deze studie tonen we aan dat zelfs veranderingen in een enkel peptide residu dat niet sterk wordt aangegrepen door een TCR onvoorspelbaar structurele wijzigingen van andere resten in de HLA-gebonden peptide, die op zijn beurt verandert dramatisch T-cel herkenning kan uitzenden. Een meer volledig begrip van de moleculaire mechanismen toegepast tijdens T-cel-antigeen herkenning zal grote voordelen bij het ontwerpen toekomstige therapieën voor een breed spectrum van menselijke ziekten.
The authors have nothing to disclose.
BM wordt ondersteund door een Cancer Research UK PhD studententijd. AG wordt ondersteund door een Life Science Research Network Wales PhD studententijd. VB wordt ondersteund door een Cancer Research Wales PhD studententijd. DKC is een Wellcome Trust Career Development Research Fellow (WT095767). AKS is een Wellcome Trust Investigator. GHM wordt gefinancierd door een gezamenlijke Life Science Research Network Wales en Tenovus Cancer Care PhD studententijd. Wij danken het personeel van Diamond Light Source voor het verstrekken van faciliteiten en ondersteuning.
S.O.C. media | Invitrogen |
Orbi-Safe New Orbit incubator | Sanyo |
carbenicillin | Sigma |
IPTG | Fisher |
Quick Coomassie Stain SafeStain | Generon |
Legend RT centrifuge | Sorvall |
Tris | Fisher |
magnesium chloride | Arcos |
NaCl | Fisher |
glycerol | Sigma-Aldrich |
Sonopuls HD 2070 | Bandelin |
DNAse | Fisher |
Triton | Sigma-Aldrich |
EDTA | Fisher |
guanidine | Fisher |
NanoDrop ND1000 | Thermo |
Peptides | Peptide Protein Research |
dithiothreitol | Sigma-Aldrich |
L-arginine | SAFC |
cysteamine | Fisher |
cystamine | Fisher |
dialysis tubing | Sigma-Aldrich |
urea | Sigma-Aldrich |
Metricel 0.45 μm membrane filter | Pall |
POROS 10/100 HQ | Applied biosystems |
ÄKTA pure FPLC system | GE Healthcare Life Sciences |
10 kDa MWCO Vivaspin 20 | Sartorius |
10 kDa MWCO Vivaspin 4 | Sartorius |
Superdex 200 10/300 GL column | GE Healthcare Life Sciences |
Phosphate Buffer Saline | Oxoid |
BIAcore buffer HBS | GE Healthcare Life Sciences |
Biotinylation kit | Avidity |
BIAcore T200 | GE Healthcare Life Sciences |
CM5 chip coupling kit | GE Healthcare Life Sciences |
streptavidin | Sigma-Aldrich |
Microcal VP-ITC | GE Healthcare Life Sciences |
Hepes | Sigma-Aldrich |
Gryphon crystallisation robot | Art Robbins Instruments |
Intelli-plate | Art Robbins Instruments |
Crystallisation screens and reagents | Molecular Dimensions |
75 cm2 flask | Greiner Bio-One |
0.22 μm filters | Miller-GP, Millipore |
Ultra-Clear ultracentrifuge tube | Beckman Coulter |
Optima L-100 XP with SW28 rotor | Beckman Coulter |
CD8 microbeads | Miltenyi Biotec |
anti-CD3/CD28 Dynabeads | Invitrogen |
anti-PE microbeads | Miltenyi Biotec |
CK medium, PHA | Alere Ltd |
anti-TCRVβ mAb | BD |
dasatinib | Axon |
MIP-1β and TNFα ELISA | R&D Systems |
51Cr | PerkinElmer |
1450 Microbeta counter | PerkinElmer |