Summary

Análisis de citometría de flujo de las células asesinas naturales lítico Actividad en sangre entera humana

Published: March 17, 2017
doi:

Summary

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

Abstract

la citotoxicidad de células NK es una medida ampliamente utilizada para determinar el efecto de la intervención exterior en función de las células NK. Sin embargo, la precisión y reproducibilidad de este ensayo pueden considerarse inestable, ya sea debido a errores del usuario o debido a la sensibilidad de las células NK a la manipulación experimental. Para eliminar estos problemas, un flujo de trabajo que les reduce al mínimo fue establecido y se presenta aquí. Para ilustrar, se obtuvieron muestras de sangre, en diversos momentos, desde corredores (n = 4) que fueron sometidos a una intensa sesión de ejercicio. En primer lugar, las células NK se identifican de forma simultánea y aislados mediante el etiquetado CD56 y la clasificación basada en magnético, directamente de la sangre entera y de tan poco como un mililitro. Las células NK según se retiran de cualquier anticuerpo reactivo o de tapado. Se puede contar con el fin de establecer un recuento de células NK precisa por mililitro de sangre. En segundo lugar, las células NK según (efectores células o E) se pueden mezclar con 3,3'-Diotadecyloxacarbocyanine perclorato (DIO) etiquetada células K562 (células diana o T) en un ensayo-óptima 1: 5 T: relación de E, y se analizó usando un citómetro de flujo de imágenes que permite la visualización de cada evento y la eliminación de cualquier falso positivo o falsos negativos (tales como dobletes o células efectoras). Este flujo de trabajo se puede completar en aproximadamente 4 h, y permite obtener resultados muy estables incluso cuando se trabaja con muestras humanas. Cuando esté disponible, los equipos de investigación pueden probar varias intervenciones experimentales en sujetos humanos, y comparar las mediciones a través de varios puntos de tiempo sin poner en peligro la integridad de los datos.

Introduction

Las células asesinas naturales son un elemento esencial del sistema inmune innato. Mientras que están muy regulados, que tienen la capacidad de reconocer y eliminar las células anormales a través del contacto de célula a célula y sin activación previa 1. Como tales, forman una línea rápida de defensa contra las infecciones. El ejercicio, especialmente intenso, se ha demostrado que deprimen de forma transitoria el sistema inmune 2, 3, 4, 5. Las células NK son particularmente propensos a este efecto 4, 6, 7, creando una ventana de aumento de la sensibilidad a la enfermedad. Por lo tanto, el estudio de las intervenciones antes, durante o después del ejercicio intenso, con el objetivo de reducir su impacto sobre la función de las células NK es de particular interés para el bienestar de los atletas después de los concursos.

<p class= "jove_content"> Sin embargo, el estudio de este tipo de intervenciones se complica por varios factores: 1) las células NK son escasos 8, en torno a 1% del compartimiento de glóbulos blancos; 2) Las células NK son muy sensibles al estrés y se basan en la exposición constante a las condiciones fisiológicas para seguir siendo viable y estable durante la experimentación; y 3) ensayos estándar para determinar la citotoxicidad de células NK, tales como gradientes de Ficoll 9 y liberan los ensayos 10, son poco fiables e inconsistente. La variabilidad inherente de las muestras de humanos sólo agravan estos problemas. muestras humanas frescas recogidas durante las intervenciones son bastante regulado y difíciles de conseguir, al menos en comparación con muestras de animales o líneas celulares inmortalizadas. Esto reduce las oportunidades para repetir los experimentos o añadir participantes a la cohorte del estudio para llegar a los umbrales estadísticos significativos. En conjunto, estas cuestiones apoyan la necesidad de un protocolo optimizado que permite for tanto de alto rendimiento y un análisis de alta fiabilidad de la actividad lítica de las células NK en muestras humanas.

Hemos establecido un flujo de trabajo que acorta el tiempo necesario para identificar, aislar y células NK prueba de la sangre entera humana y reducir al mínimo la exposición a factores externos. El método optimiza el uso de dos instrumentos, un clasificador basado en magnética celular y un flujo de imágenes citómetro, y un, T optimizado ensayo específico: relación E para permitir la detección de las disminuciones o incrementos de la citotoxicidad de células NK.

Protocol

NOTA: Todos los procedimientos de recolección de sangre se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices establecidas por la Universidad Estatal de los Apalaches (ASU) Junta de Revisión Institucional (IRB). 1. Extracción de sangre entera Tiene un flebotomista certificado extraer la sangre según las directrices de la Organización Mundial de la Salud. Extraer la sangre en un tubo de recogida de sangre de 4 ml que contenía ácido etilendiaminotetraacético Di-Potasio…

Representative Results

Determinación del número de células NK Se midió el efecto de la pesada que se ejecuta en el recuento de células NK en la sangre total, utilizando el protocolo de ejercicio descrito en la figura 2. Las muestras de sangre fueron extraídas antes del ejercicio, inmediatamente después del ejercicio, 1,5 horas después del ejercicio, y, finalmente, 24 y 48 h después de la extracción de sangre inicial. La concentración de las células NK por mililitro de sangre…

Discussion

El método descrito en este estudio mide directamente la actividad específica de las células NK de un individuo en respuesta a estímulos (en este caso particular, el ejercicio prolongado). Típicamente, las células NK están aisladas de la propia sangre usando gradientes de densidad o clasificación de células mediante el uso de una combinación de marcadores. Aunque se utilizan ampliamente estos métodos, que tienen muchos inconvenientes: son mucho tiempo, implican múltiples manipulaciones, y son en gran medida d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This project was supported by Agriculture and Food Research Initiative Competitive Grant no. 2100-68003-30395 from the USDA National Institute of Food and Agriculture.

Materials

K-562 lymphoblasts ATCC CCL-243
Iscove's Modified Dulbecco's Media ATCC 30-2005 High glucose, with L-Glutamine, with HEPES, Sterile-filtered
Alpha Minimum Essential medium ATCC CRL-2407 Without ribonucleosides and deoxyribonucleosides but with 2 mM L-glutamine and 1.5 g/L sodium bicarbonate
Trypan Blue Solution 0.4% Amresco K940-100ML Tissue culture grade
Propridium Iodide Staining Solution BD Pharmingen 51-66211E
Vybranto DiO cell-labeling solution Vybranto V-22886
autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec 130-092-545
autoMACS Running Buffer Miltenyi Biotec 130-091-221
autoMACS Washing Buffer Miltenyi Biotec 130-092-987
autoMACS Columns Miltenyi Biotec 130-021-101
Whole Blood CD56 MicroBeads, human Miltenyi Biotec 130-090-875
ImageStream X Mark II Imaging Flow Cytometer EMD Millipore
Speedbeads Amnis Corporation 400030
0.4-0.7% Hypochlorite (Sterilizer) VWR JT9416-1
Coulter Clenz Beckman Coulter 8546929
70% Isopropanol (Debubbler) EMD Millipore 1.3704
D-PBS (Sheath fluid) EMD Millipore BSS-1006-B (1X) No calcium or magnesium
INSPIRE Software EMD Millipore Version Mark II, September 2013
Ideas Application Software EMD Millipore Version 6.1, July 2014

References

  1. Cerwenka, A., Lanier, L. L. Natural killer cells, viruses and cancer. Nat Rev Immunol. 1 (1), 41-49 (2001).
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Cite This Article
McBride, J. E., Meaney, M. P., John, C., Nieman, D. C., Warin, R. F. Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood. J. Vis. Exp. (121), e54779, doi:10.3791/54779 (2017).

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