Summary

Flusso analisi di citometria di Natural Killer cellulare Lytic attività nel Sangue umano intero

Published: March 17, 2017
doi:

Summary

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

Abstract

citotossicità delle cellule NK è una misura ampiamente utilizzato per determinare l'effetto di un intervento esterno sulla funzione delle cellule NK. Tuttavia, la precisione e la riproducibilità di questo test possono essere considerati instabili, sia a causa di errori dell'utente oa causa della sensibilità delle cellule NK di manipolazione sperimentale. Per eliminare questi problemi, un flusso di lavoro che li riduce al minimo è stato stabilito ed è presentato qui. Per illustrare, abbiamo ottenuto campioni di sangue, in vari momenti, da corridori (n = 4), che sono stati sottoposti ad un intenso periodo di esercizio. In primo luogo, le cellule NK sono contemporaneamente identificati e isolati attraverso CD56 tagging e smistamento magnetico-based, direttamente dal sangue intero e da un minimo di un millilitro. Le cellule NK ordinati vengono rimossi di eventuali anticorpi reagenti o tappatura. Essi possono essere contati per stabilire un accurato conteggio delle cellule NK per millilitro di sangue. In secondo luogo, le cellule NK ordinati (effettori cellule o E) possono essere miscelati con 3,3'-Diotadecyloxacarbocyanine perclorato (DIO) etichettato cellule K562 (cellule bersaglio o T) in un saggio-ottimale 1: 5 T: rapporto E e analizzato utilizzando un flusso-citometria di imaging che permette la visualizzazione di ogni evento e l'eliminazione di falsi positivi o falsi negativi (come doppiette o cellule effettrici). Questo flusso di lavoro può essere completato in circa 4 ore, e consente di ottenere risultati molto stabili anche quando si lavora con campioni umani. Quando disponibile, gruppi di ricerca possono testare diversi interventi sperimentali in soggetti umani, e confrontare le misurazioni attraverso diversi punti di tempo senza compromettere l'integrità dei dati.

Introduction

cellule killer naturali sono un elemento essenziale del sistema immunitario innato. Mentre sono molto disciplinati, hanno la capacità di riconoscere ed eliminare le cellule anomale attraverso il contatto cellula-cellula e senza attivazione preventiva 1. Come tali, essi formano una linea veloce di difesa contro le infezioni. Esercizio, particolarmente intenso, ha dimostrato di deprimere transitoriamente il sistema immunitario 2, 3, 4, 5. Cellule NK sono particolarmente soggetti a questo effetto 4, 6, 7, creando una finestra di una maggiore sensibilità alla malattia. Pertanto, lo studio di interventi prima, durante o dopo un intenso esercizio con l'obiettivo di ridurre l'impatto sulla funzione delle cellule NK è di particolare interesse per il benessere degli atleti post-concorsi.

<p class= "jove_content"> Tuttavia, lo studio di tali interventi è complicata da numerosi fattori: 1) le cellule NK sono sparse 8, a circa l'1% del vano globuli bianchi; 2) le cellule NK sono molto sensibili allo stress e si basano su costante esposizione a condizioni fisiologiche di rimanere vitali e stabile durante la sperimentazione; e 3) test standard per determinare la citotossicità delle cellule NK, come Ficoll gradienti 9 e rilasciare dosaggi 10, sono inaffidabili e inconsistenti. La variabilità intrinseca dei campioni umani composti soltanto questi problemi. campioni umani freschi raccolti durante interventi sono abbastanza regolamentato e difficili da procurare, almeno rispetto ai campioni animali o linee cellulari immortalizzate. Questo riduce la possibilità di ripetere gli esperimenti o aggiungere partecipanti allo studio di coorte per raggiungere significativi soglie statistiche. Collettivamente, questi problemi sostengono la necessità di un protocollo semplificato che permette FOR sia high-throughput e l'analisi ad alta affidabilità di NK attività litica delle cellule in campioni umani.

Abbiamo stabilito un flusso di lavoro che riduce il tempo necessario per identificare, isolare e le cellule NK di prova da sangue intero umano, riducendo al minimo l'esposizione a fattori estranei. Il metodo ottimizza l'uso di due strumenti, un sorter magnetico a base cellulare e un flusso di imaging citometro, ed una, T ottimizzata specifico per il dosaggio: rapporto E per consentire il rilevamento di diminuzioni o incrementi di citotossicità delle cellule NK.

Protocol

NOTA: Tutte le procedure di raccolta del sangue sono state condotte in conformità con le linee guida stabilite dalla Appalachian State University (ASU) Institutional Review Board (IRB). 1. Raccolta Sangue intero Avere un flebotomo certificato prelevare il sangue secondo le linee guida dell'Organizzazione Mondiale della Sanità. Disegnare il sangue in un 4 ml di tubo di raccolta del sangue contenente acido Di-Potassio etilendiamminotetraacetico (K 2 EDTA)….

Representative Results

Determinazione del numero di cellule NK L'effetto della corsa pesante sul conteggio delle cellule NK nel sangue intero è stato misurato, utilizzando il protocollo di esercizio descritto nella Figura 2. I campioni di sangue sono stati elaborati prima dell'esercizio, immediatamente dopo l'esercizio, 1,5 ore dopo l'esercizio, e, infine, 24 e 48 ore dopo il prelievo di sangue iniziale. La concentrazione di cellule NK per millilitro di sangue intero è…

Discussion

Il metodo descritto in questo studio misura direttamente l'attività specifica di cellule NK di un individuo in risposta a stimoli (in questo caso particolare, esercizio prolungato). Tipicamente, le cellule NK sono isolati dal proprio sangue utilizzando gradienti di densità o di separazione delle cellule utilizzando una combinazione di marcatori. Mentre questi metodi sono ampiamente utilizzati, hanno molti svantaggi: sono in termini di tempo, coinvolgono più manipolazioni, e sono fortemente dipendenti dell'ute…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This project was supported by Agriculture and Food Research Initiative Competitive Grant no. 2100-68003-30395 from the USDA National Institute of Food and Agriculture.

Materials

K-562 lymphoblasts ATCC CCL-243
Iscove's Modified Dulbecco's Media ATCC 30-2005 High glucose, with L-Glutamine, with HEPES, Sterile-filtered
Alpha Minimum Essential medium ATCC CRL-2407 Without ribonucleosides and deoxyribonucleosides but with 2 mM L-glutamine and 1.5 g/L sodium bicarbonate
Trypan Blue Solution 0.4% Amresco K940-100ML Tissue culture grade
Propridium Iodide Staining Solution BD Pharmingen 51-66211E
Vybranto DiO cell-labeling solution Vybranto V-22886
autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec 130-092-545
autoMACS Running Buffer Miltenyi Biotec 130-091-221
autoMACS Washing Buffer Miltenyi Biotec 130-092-987
autoMACS Columns Miltenyi Biotec 130-021-101
Whole Blood CD56 MicroBeads, human Miltenyi Biotec 130-090-875
ImageStream X Mark II Imaging Flow Cytometer EMD Millipore
Speedbeads Amnis Corporation 400030
0.4-0.7% Hypochlorite (Sterilizer) VWR JT9416-1
Coulter Clenz Beckman Coulter 8546929
70% Isopropanol (Debubbler) EMD Millipore 1.3704
D-PBS (Sheath fluid) EMD Millipore BSS-1006-B (1X) No calcium or magnesium
INSPIRE Software EMD Millipore Version Mark II, September 2013
Ideas Application Software EMD Millipore Version 6.1, July 2014

References

  1. Cerwenka, A., Lanier, L. L. Natural killer cells, viruses and cancer. Nat Rev Immunol. 1 (1), 41-49 (2001).
  2. Nieman, D. C. Exercise, infection, and immunity. Int J Sports Med. 15, 131-141 (1994).
  3. Romeo, J., Warnberg, J., Pozo, T., Marcos, A. Physical activity, immunity and infection. Proc Nutr Soc. 69 (3), 390-399 (2010).
  4. Nieman, D. C. Marathon training and immune function. Sports Med. 37 (4-5), 412-415 (2007).
  5. Simpson, R. J., Kunz, H., Agha, N., Graff, R. Exercise and the Regulation of Immune Functions. Prog Mol Biol Transl Sci. 135, 355-380 (2015).
  6. Walsh, N. P., et al. Position statement. Part one: Immune function and exercise. Exerc Immunol Rev. 17, 6-63 (2011).
  7. Timmons, B. W., Cieslak, T. Human natural killer cell subsets and acute exercise: a brief review. Exerc Immunol Rev. 14, 8-23 (2008).
  8. Westermann, J., Pabst, R. Distribution of lymphocyte subsets and natural killer cells in the human body. Clin Investig. 70 (7), 539-544 (1992).
  9. Boyum, A. Isolation of leucocytes from human blood. Further observations. Methylcellulose, dextran, and ficoll as erythrocyteaggregating agents. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 31-50 (1968).
  10. McMillan, R., Scott, J. L. Leukocyte labeling with 51-Chromium. I. Technic and results in normal subjects. Blood. 32 (5), 738-754 (1968).
  11. Berk, L. S., et al. The effect of long endurance running on natural killer cells in marathoners. Med Sci Sports Exerc. 22 (2), 207-212 (1990).
  12. McAnulty, L. S., et al. Effect of blueberry ingestion on natural killer cell counts, oxidative stress, and inflammation prior to and after 2.5 h of running. Appl Physiol Nutr Metab. 36 (6), 976-984 (2011).
  13. Millard, A. L., et al. Brief Exercise Increases Peripheral Blood NK Cell Counts without Immediate Functional Changes, but Impairs their Responses to ex vivo Stimulation. Front Immunol. 4, 125 (2013).
  14. Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. J. . Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. 5th edn. , (2001).

Play Video

Cite This Article
McBride, J. E., Meaney, M. P., John, C., Nieman, D. C., Warin, R. F. Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood. J. Vis. Exp. (121), e54779, doi:10.3791/54779 (2017).

View Video