генотипирование<em> Стафилококк</em> рибосомальным Spacer ПЦР (RS-PCR)

Summary

Here, ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is used together with a miniaturized electrophoresis system as a fast and high resolution method for genotyping S. aureus at moderate costs allowing a high throughput.

Abstract

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, therefore, suitable to be used for routine purposes. For best resolution, data evaluation and data management, a miniaturized electrophoresis system is required. Together with such an electrophoresis system and the in-house developed software (freely available here) assignment of the pattern of bands to a genotype is standardized and straight forward. DNA extraction is simple (boiling prep), setting-up of the reactions is easy and they can be run on any standard PCR machine. PCR cycling is common except prolonged ramping and elongation times. Compared to spa typing and Multi Locus Sequence Typing (MLST), RS-PCR does not require DNA sequencing what simplifies the analysis considerably and allows a high throughput. Furthermore, the resolution for bovine strains of S. aureus is at least as good as spa typing and better than MLST or pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). The RS-PCR data base includes presently a total of 141 genotypes and variants. The method is highly associated with the virulence gene pattern, contagiosity and pathogenicity of S. aureus strains involved in bovine mastitis. S. aureus genotype B (GTB) is contagious and causes herds problems causing large costs in the Switzerland and other European countries. All the other genotypes observed in Switzerland infect individual cows and quarters. Genotyping by RS-PCR allows the reliable prediction of the epidemiological and the pathogenic potential of S. aureus involved in bovine intramammary infection (IMI), two key factors for clinical veterinary medicine. Because of these beneficial properties together with moderate costs and a high sample throughput the goal of this publication is to give a detailed, step-by-step protocol for easily establishing and running RS-PCR for genotyping S. aureus in other laboratories.

Introduction

Стафилококк (S. стафилококк) известен как самый важный патоген во всем мире , ответственного за интрамаммарной инфекции (IMI) у крупного рогатого скота ^1. Исследование , проведенное Fournier и соавт. ² продемонстрировано в швейцарских коров и исследованиях Cosandey и др. ³ и Boss и др. ⁴ у коров 12 европейских стран , что С. стафилококк , выделенной из бычьих ИМИ представляет собой генетически гетерогенную группу. С помощью ПЦР – амплификации межгенном спейсерной области 16S-23S рРНК (RS-PCR), в общей сложности 17 генотипами были первоначально обнаружены в 101 эпидемиологически независимых изолятов ^2. Генотип В и генотипа С (КТЗ) были наиболее распространенным (80%), в то время как остальные 15 генотипов (ГСТ) происходили редко, каждый из которых вносит 1 до 4% от всех изолятов. На европейском уровне ^3, GTB, GTC, ГТФ, GTI и GTR были самыми важными генотипы , содержащие 76% всех анализируемых штаммов (n = 456). GTB был расположен в центральной части Европы, шhereas другие генотипы были широко распространены. Остальные 24% штаммов включали 41 генотипов, многие из них, однако, наблюдались только один раз.

В работах Fournier и соавт. ^2, Cosandey и др. , ^3, и Грабером и др. ⁵ дополнительно показано , что генотипы были высоко связаны с их рисунком генов вирулентности, а также на швейцарцев , как на европейском уровне. Исследования дополнительно выявил массовые различия в распространенности среди IMI S. стафилококк GTB, GTC и другие генотипы ^2,5: учитывая GTB, до 87% коров в стаде были заражены этим генотипом. В случае GTC и других генотипов, однако, IMI был только найден в 1 до 2 коров стада.

IMI , вызванные S. стафилококк, как правило , приводит к воспалению соответствующих молочных желез и увеличение воспалительных клеток в молоке. Как следствие, соматической клетки совместноунц в молоке (SCC), основным показателем качества молока в большинстве стран, увеличивается, приводящий к снижению цен на молоко или даже доставки остановки.

Кроме того, RS-PCR из Fournier и др. ^2, другие методы типирования были описаны для подтипов бычьим штаммам S. из стафилококк ^8-11. Два наиболее часто встречающиеся из них включают спа набрав ¹² и мульти Locus последовательность ввода (MLST) ^13. Первый из них основан на секвенирование ДНК переменной спейсерной области стафилококкового гена Spa кодирующего белок А, тогда как последний из них требует секвенирование 7 генов домашнего хозяйства. Это означает , что один ¹² и семь ДЗП ^13, соответственно, должны быть выполнены, с последующей очисткой ампликона, реакции секвенирования и анализа с использованием специального оборудования. По сравнению с RS-PCR, эти методы требуют значительных дополнительных усилий в лабораторных условиях, что приводит к низкой пропускной способности образца и высокой стоимостью.пропускная способность особенно низка для PFGE. Принимая во внимание решение этих методов для бычьих штаммов S. стафилококк, RS-PCR, по крайней мере так же хорошо , как спа , набрав ⁴ и лучше , чем MLST ⁴ или PFGE ^15.

Все эти методы , включая бинарного ввода ¹³ продемонстрировали свою эффективность в получении дальнейшее понимание патогенеза крупного рогатого скота IMI , вызванного S. стафилококк, но из – за указанных ограничений они менее подходят для крупных клинических исследований. Кроме того, с помощью генотипирования RS-PCR , как описано Fournier и др. ² позволяет надежно предсказывать эпидемиологические и патогенного потенциала S. стафилококк участвует в коровьем IMI, два ключевых значения в клинической ветеринарной медицины.

Protocol

1. стафилококк изоляты Спред 10 мкл S. Исходную культуру стафилококка или одной колонии выращивают на селективной среде на чашках с агаром Columbia , содержащей 5% овечьей крови (BA). Выдержите аэробно при температуре 37 ° С в течение 18 часов до 24 часов. <p class="jove_…

Representative Results

Определение генотипа и его варианты Электрофоретический профиль отличаясь более чем в одной группе из всех идентифицированных генотипов рассматривается как нового генотипа. Новые генотипы названы и расширены в соответствии с Fournier ?…

Discussion

Самый важный шаг всей процедуры, когда есть избыток ДНК в RS-PCR (> 30 нг чистой ДНК / анализа) ^2. В общем, разрешение профиля является оптимальным, если все его пиков начинаются и заканчиваются в базовой линии. Если два пика слишком близко друг к другу, резолюция является неполной. В эти…

Materials

Tris(hydroxymethyl)-aminomethan	Merck	1.08382.0500	Mw =121.14g/mol
Titriplex III	Merck	1.08418.0250	Mw = 372.24g/mol; Substance is equivalent to Na2EDTA·2H2O
Hydrochloric acid 5mol/l	Merck	1.09911.0001
Columbia agar+5% sheep blood	bioMérieux	43049
Agilent DNA7500 Kit	Agilent Technologies	5067-1504
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2940CA
Agilent 2100 expert sofware	Agilent Technologies
HotStarTaq master mix	Qiagen	203445
Primer L1	Mycrosinth		5'CAA GGC ATC CAC CGT3'
Primer G1	Mycrosinth		5'GAA GTC GTA ACA AGG3'