Genotypisierung<em> Staphylococcus aureus</em> Durch ribosomalen Spacer PCR (RS-PCR)

Summary

Here, ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is used together with a miniaturized electrophoresis system as a fast and high resolution method for genotyping S. aureus at moderate costs allowing a high throughput.

Abstract

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, therefore, suitable to be used for routine purposes. For best resolution, data evaluation and data management, a miniaturized electrophoresis system is required. Together with such an electrophoresis system and the in-house developed software (freely available here) assignment of the pattern of bands to a genotype is standardized and straight forward. DNA extraction is simple (boiling prep), setting-up of the reactions is easy and they can be run on any standard PCR machine. PCR cycling is common except prolonged ramping and elongation times. Compared to spa typing and Multi Locus Sequence Typing (MLST), RS-PCR does not require DNA sequencing what simplifies the analysis considerably and allows a high throughput. Furthermore, the resolution for bovine strains of S. aureus is at least as good as spa typing and better than MLST or pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). The RS-PCR data base includes presently a total of 141 genotypes and variants. The method is highly associated with the virulence gene pattern, contagiosity and pathogenicity of S. aureus strains involved in bovine mastitis. S. aureus genotype B (GTB) is contagious and causes herds problems causing large costs in the Switzerland and other European countries. All the other genotypes observed in Switzerland infect individual cows and quarters. Genotyping by RS-PCR allows the reliable prediction of the epidemiological and the pathogenic potential of S. aureus involved in bovine intramammary infection (IMI), two key factors for clinical veterinary medicine. Because of these beneficial properties together with moderate costs and a high sample throughput the goal of this publication is to give a detailed, step-by-step protocol for easily establishing and running RS-PCR for genotyping S. aureus in other laboratories.

Introduction

Staphylococcus (S. aureus) als wichtigste Erreger weltweit verantwortlich für die intramammäre Infektion (IMI) bei Rindern ¹ bekannt. Die Studie wurde von Fournier et al. ² in Schweizer Kühe unter Beweis gestellt und die Studien von Cosandey et al. ³ und Boss et al. ⁴ bei Kühen von 12 europäischen Ländern , dass S. aureus isoliert aus Rinder IMI ist eine genetisch heterogene Gruppe. Durch PCR – Amplifikation des 16S-23S – rRNA intergenischen Spacer – Region (RS-PCR), insgesamt 17 Genotypen wurden zunächst in 101 epidemiologisch unabhängige Isolate ² detektiert. Genotype B und Genotyp C (AGB) wurden am häufigsten (80%), während die anderen 15 Genotypen (GTs) selten aufgetreten, jeder macht 1 bis 4% aller Isolate. Auf europäischer Ebene ^3, GTB, GTC, GTF, GTI und GTR waren die wichtigsten Genotypen 76% aller untersuchten Stämme, die (n = 456). GTB wurde in Mitteleuropa während die anderen Genotypen wurden weit verbreitet. Die restlichen 24% der Stämme enthalten 41 Genotypen, von denen viele, aber nur einmal beobachtet.

Die Studien von Fournier et al. ^2, Cosandey et al. ³ und Graber et al. ⁵ weiter gezeigt , dass die Genotypen stark mit ihrer Virulenz – Gen – Muster verbunden waren, sowie an der Schweizer wie auf europäischer Ebene. Die Untersuchungen ergaben , weitere massive Unterschiede in IMI – Prävalenz unter S. aureus GTB, GTC und die anderen Genotypen ^2,5: Berücksichtigung GTB, bis zu 87% der Kühe in einer Herde wurden von diesem Genotyp infiziert. Im Falle von GTC und der anderen Genotypen, jedoch wurde IMI nur in 1 bis 2 Kühen einer Herde gefunden.

IMI verursacht durch S. aureus, führt normalerweise zu einer Entzündung der entsprechenden Brustdrüsen und einem Anstieg von Entzündungszellen in der Milch. Als Folge co die somatische Zellunts in Milch (SCC), dem Schlüsselindikator für die Milchqualität in den meisten Ländern, erhöht wird, um eine verringerte Milchpreis oder sogar Lieferstopp führt.

Neben dem RS-PCR von Fournier et al. ^2, haben andere Typisierungsmethoden für Subtypisierung Rinder Stämme von S. beschrieben aureus ^11.08. Zwei häufigsten sind Spa – Typisierung ¹² und Multi – Locus – Sequenz Typing (MLST) ^13. Der erstere wird basierend auf DNA – Sequenzierung der variablen Spacer – Bereich des Staphylokokken – Spa Gen , das für Protein A, während die letztere die Sequenzierung von 7 Housekeeping – Genen erfordert. Dies bedeutet , dass eine ¹² bis sieben PCRs ¹³ jeweils durchgeführt werden müssen, gefolgt von Amplicon Reinigung Sequenzierungsreaktion und Analyse unter Verwendung spezifischer Ausrüstung. Im Vergleich zu RS-PCR, erfordern diese Verfahren einen erheblichen Mehraufwand in der resultierenden Labor in einem geringen Probendurchsatz und hohe Kosten. DasDurchsatz besonders niedrig ist die PFGE. Unter Berücksichtigung der Auflösung dieser Methoden für Rinder Stämme von S. aureus, RS-PCR ist mindestens so gut wie spa Eingabe ⁴ und besser als MLST ⁴ oder PFGE ^15.

Alle diese Methoden auch binäre Typisierung ¹³ gezeigt , um ihre Wirksamkeit bei der Beschaffung weitere Einblicke in die Pathogenese von Rinder-IMI verursacht durch S. aureus, aber wegen der genannten Einschränkungen sind sie weniger geeignet für große klinische Untersuchungen. Zusätzlich Genotypisierung von RS-PCR wie von Fournier et al. ² ermöglicht die zuverlässige Vorhersage der epidemiologischen und das pathogene Potential von S. aureus in Rinder-IMI, zwei Schlüsselwerte in der klinischen Veterinärmedizin beteiligt.

Protocol

1. Staphylococcus aureus – Isolaten Verbreiten Sie 10 ul S. aureus Stammkultur oder eine Kolonie auf einem selektiven Medium gezüchtet auf Columbia – Agar – Platten , die 5% Schafblut (BA). Inkubieren aerob bei 37 ° C für 18 Stunden bis 24 Stunden. 2. DNA-Extraktion Bereiten TEL – Puffer , enthaltend 10 mM Tris-HCl und 10 mM Na 2 EDTA, pH 8,5. Bereiten Aliquots und Autoklaven bei 121 ° C für 15 min. Sa…

Representative Results

Definition eines Genotyp und seine Varianten Eine elektrophoretische Profil in mehr als ein Band aus allen identifizierten Genotypen unterschiedlichen wird als neuer Genotyp betrachtet. Neue Genotypen werden nach Fournier et al genannt und erweitert. 5 mit den Genotypen GTA GTZ führt, die von den Genotypen GTAA zu GTAZ gefolgt, und GTBA zu GTBZ und GTCA zu AVB derzeit. Variation in nur einem Band …

Discussion

Der wichtigste Schritt des gesamten Verfahrens ist , wenn ein Überschuß an DNA in RS-PCR ist (> 30 ng reine DNA / assay) ^2. Im allgemeinen Auflösung eines Profils ist optimal, wenn alle ihre Spitzen an der Grundlinie beginnen und enden. Wenn zwei Spitzen zu nahe beieinander sind, die Auflösung ist unvollständig. Unter diesen Bedingungen kann die Bioanalyzer Software zu unangemessenen Spitzen Identifizierung führen, so dass die manuelle Identifikation erforderlich ist.

All…

Materials

Tris(hydroxymethyl)-aminomethan	Merck	1.08382.0500	Mw =121.14g/mol
Titriplex III	Merck	1.08418.0250	Mw = 372.24g/mol; Substance is equivalent to Na2EDTA·2H2O
Hydrochloric acid 5mol/l	Merck	1.09911.0001
Columbia agar+5% sheep blood	bioMérieux	43049
Agilent DNA7500 Kit	Agilent Technologies	5067-1504
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2940CA
Agilent 2100 expert sofware	Agilent Technologies
HotStarTaq master mix	Qiagen	203445
Primer L1	Mycrosinth		5'CAA GGC ATC CAC CGT3'
Primer G1	Mycrosinth		5'GAA GTC GTA ACA AGG3'