This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.
This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.
communautés bactériennes multi-cellulaires jouent un rôle important dans les milieux naturels et anthropiques, et peuvent être bénéfiques ou très néfaste. Ces colonies multicellulaires sont appelées biofilms, dans lequel les cellules individuelles sont noyées dans une (EPS) de la matrice extracellulaire des substances polymères auto-produites. Les EPS adhèrent fortement les cellules à la surface qu'ils colonisent. Ils servent de bouclier contre les forces mécaniques et chimiques et de créer un contact étroit entre les cellules voisines, ce qui facilite la communication cellulaire 1. Un biofilm peut être considérée comme une communauté différenciée, où les cellules utilisent très réglementées, orchestré des processus pour coordonner leurs activités au sein de la communauté, ainsi que toutes les espèces 2-5. La transition d'un planctoniques, mode libre-vie de la croissance à un état de biofilm est souvent associée à des processus de développement. Un bon exemple est la bactérie du sol Bacillus subtilis Gram positif, et donc un undómësouche sticated sert organisme modèle robuste pour étudier les étapes du développement menant à la formation de biofilm. Dans cette bactérie, cellules mobiles s'organisent en structures multicellulaires visibles qui effectuent des tâches spécialisées 4. Un groupe de cellules, la matrice producteurs sécrètent exopolysaccharides 6, la protéine amyloïde Tasa 7,8, et la protéine de surface hydrophobe BSLA 9,10; qui tous participent à l'assemblage des EPS 11-13.
Compte tenu de l'abondance des biofilms dans des niches naturelles et anthropiques et les dommages mortels putative ils peuvent causer, il y a un besoin urgent de trouver des moyens de prévenir leur formation. Les inhibiteurs de petites molécules peuvent aider à la découverte de nouvelles voies de régulation, des enzymes et des protéines structurales impliquées dans la formation de biofilm, et promouvoir ainsi un aperçu des processus complexes de l'ensemble de la communauté multicellulaire. Comme B. subtilis est un modèle bien étudié pour la bioformation d' un film 14,15, il peut être utilisé pour évaluer les effets de divers inhibiteurs de biofilm. Cette étude aborde quatre méthodes fondamentales qui sont essentielles pour évaluer la réponse des biofilms aux inhibiteurs de petites molécules. Tout d'abord, pour s'assurer que ces inhibiteurs ont une cible spécifique de biofilm, la séparation de l'effet sur la croissance planctonique de l'effet sur la formation de biofilm est critique. La plupart des agents antibactériens cellules cibles dans leur phase de croissance planctonique, mais des molécules qui ciblent le mode de vie de biofilm sont rares. En outre, en tant que molécules qui ne touchent pas la croissance planctonique ne sont pas toxiques, ils peuvent réduire la pression sélective favorisant des mutants résistants aux antibiotiques 16. Par exemple, lorsque les biofilms sont traités avec des acides aminés D ou de certaines autres molécules de paroi interférant cellule, ils sont soit perturbés ou démontées, mais ces inhibiteurs affectent seulement légèrement 12,17 croissance planctonique. En revanche, de nombreux antibiotiques altèrent considérablement la croissance planctonique, avec little ou pas d' effet sur la formation de biofilm 17.
Deuxièmement, l'établissement d'un cadre expérimental cohérente et solide pour étudier l'effet des petites molécules est cruciale. Nous avons observé que la plage de concentration active d'inhibiteurs de petites molécules est sensible aux conditions de préculture et le dispositif expérimental utilisé pour étudier l'effet de ces inhibiteurs à petites molécules. Divers rapports, en particulier ceux qui étudient B. subtilis, a révélé des variations dans la plage de concentration à laquelle les acides D-aminés inhibent la formation de pellicules – les biofilms bactériens flottants 12,17-19. Les résultats présentés ici suggèrent que les facteurs suivants expliquent les différences dans la gamme de concentration active: les conditions de pré-culture (logarithmique 12,17 par rapport à la phase tardive stationnaire 20 croissance), le milieu de croissance utilisé dans l'état pré-culture (riche, undefined [Luria Broth, LB] par rapport défini [glutamate monosodique-glycérol, MSgg]), le rapport d'inoculation et en particulier l'élimination du milieu de pré-culture avant l'inoculation. La température de croissance pelliculaire statique a montré un rôle moins important dans le domaine d'activité de l'inhibiteur de petite molécule de D-leucine, représentant un acide D-aminé utilisé dans la présente étude.
Enfin, une fois que les biofilms sont traités avec des inhibiteurs de biofilm spécifiques, des méthodes robustes et informatives sont nécessaires pour caractériser les effets de ces inhibiteurs sur biofilm fitness. Ici, deux méthodes pour caractériser de façon indépendante l'effet des inhibiteurs de petites molécules sont décrits en détail: (1) L'effet sur des cellules individuelles au sein d'une colonie du biofilm et leur résistance aux agents antimicrobiens. Les cellules dans les biofilms sont généralement plus résistantes aux antibiotiques par rapport à des bactéries vivant librement 21-23. Bien que ce phénomène est multifactorielle, la capacité des EPS pour réduire la pénétration des antibiotiques a souvent été considérée comme une explication attrayante 24 </sup>. Cette méthode évalue la survie des cellules pré-établies biofilm après exposition à des substances antibactériennes. (2) L'effet sur l'architecture biofilm de la colonie, de la grande à la petite échelle. les colonies biofilm se caractérisent par leur structure tridimensionnelle et la présence de l'EPS. En utilisant la microscopie électronique à balayage, des changements dans la morphologie cellulaire, la structure de la colonie du biofilm et l'architecture et l'abondance de l'EPS peut être visualisée à partir de la grande taille (mm) à la petite échelle (um).
Biofilms de Bacillus subtilis formes robustes et très structurés dans les deux liquides (pellicules) et sur un milieu solide (colonies). Par conséquent, il sert d'organisme modèle idéal pour caractériser le mode d'action des inhibiteurs de biofilm spécifiques. Sur un support solide, les cellules forment une structure multicellulaire présentant des caractéristiques distinctives qui ne sont pas évidents dans des pellicules, telles que les rides rayonnant à partir du centre vers le bord. Ainsi, …
The authors have nothing to disclose.
Electron microscope imaging was conducted at the Electron Microscopy Unit of the Weizmann Institute of Science, supported in part by the Irving and Cherna Moskowitz Center for Nano and Bio-Nano Imaging. This research was also supported by the ISF I-CORE grant 152/1, Mr. and Mrs. Dan Kane, Ms. Lois Rosen, by a Yeda-Sela research grant, by the Larson Charitable Foundation, by Ruth and Herman Albert Scholars Program for New Scientists, by the Ilse Katz Institute for Materials Sciences and Magnetic Resonance Research grant, by the Ministry of Health grant for alternative research methods, and by the France-Israel Cooperation – Maimonide-Israel Research Program. IKG is a recipient of the Rowland and Sylvia Career Development Chair.
Luria Broth, Lennox | Difco | 240230 | |
Bacto Agar | Difco | 214010 | |
potassium phosphate monobasic | Sigma, 136.09 g/mol | P0662-500G | |
potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific, 174.18 g/mol | BP363-1 | |
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid | Fisher Scientific, 209.27 g/mol | BP308-500 | |
magnesium chloride hexahydrate | Merck, 203.30 g/mol | 1.05833.0250 | |
calcium chloride anhydrous | J.T. Baker, 110.98 g/mol | 1311-01 | |
manganese(II) chloride tetrahydrate | Sigma, 197.91 g/mol | 31422-250G-R | |
iron(III) chloride hexahydrate | Sigma, 270.30 g/mo) | F2877-500G | |
zinc chloride anhydrous | Acros Organics, 136.29 g/mol | 424592500 | |
thiamine hydrochloride | Sigma, 337.27 g/mol | T1270-100G | |
L-tryptophan | Fisher Scientific, 204.1 g/mol | BP395-100 | |
L-phenylalanine | Sigma, 165.19 g/mol | P5482-100G | |
L-threonine | Sigma, 119.12 g/mol | T8625-100G | |
glycerol anhydrous | Bio-Lab Itd | 712022300 | |
L-glutamic acid monosodium salts hydrate | Sigma, 169.11 g/mol | G1626-1KG | |
D-leucine | Sigma, 169.11 g/mol | 855448-10G | |
ethanol anhydrous | Gadot | 830000054 | |
razor blade | Eddison | NA | |
circular cellulose filter papers | Whatman, 90 mm | 1001-090 | |
glutaraldehyde | EMS (Electron Micoscopy Science), 25% in water | 16220 | |
paraformaldehyde | EMS, 16% in water | 15710 | |
sodium cacodylate | Merck, 214.05 g/mol | 8.2067 | |
calcium chloride 2-hydrate | Merck, 147.02 g/mol | 1172113 | |
stub-aluminium mount | EMS, sloted head | 75230 | |
carbon adhesive tape | EMS | 77825-12 | |
Shaker 37°C | New Brunswick Scientific Innowa42 | NA | |
Centrifuge | Eppendorf table top centrifuge 5424 | NA | |
Digital Sonifier, Model 250, used with Double Step Microtip | Branson | NA | |
Incubator 30 °C | Binder | NA | |
Incubator 23 °C | Binder | NA | |
Filter System, 500 ml, polystyrene | Cornig Incorporated | NA | |
Rotary Shaker – Orbitron Rotatory II | Boekel | NA | |
S150 Sputter Coater | Edwards | NA | |
CPD 030 Critical Point Dryer | BAL-TEC | NA | |
Environmental Scanning Electron Microscope | XL30 ESEM FEG Philips (FEI) | NA |