Summary

Methodologieën voor het bestuderen<em> B. subtilis</em> Biofilms als een model voor het karakteriseren van Small Molecule biofilminhibitoren

Published: October 09, 2016
doi:

Summary

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

Abstract

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Introduction

Multi-cellulaire bacteriële gemeenschappen spelen een belangrijke rol in natuurlijke en anthropogene omgevingen, en kan nuttig of zeer schadelijk zijn. Deze meercellige kolonies bekend als biofilms, waarbij de afzonderlijke cellen zijn ingebed in een zelf geproduceerde extracellulaire polymere stoffen (EPS) matrix. De EPS sterk hechten de cellen aan het oppervlak ze koloniseren. Ze dienen als een schild tegen mechanische en chemische krachten en het creëren van nauw contact tussen naburige cellen, cellulaire communicatie 1 te vergemakkelijken. Een biofilm kan worden gezien als een gedifferentieerd gemeenschap, waar de cellen in hoge mate gebruik gereguleerd, georkestreerd processen om hun activiteiten binnen de gemeenschap te coördineren, evenals verschillende diersoorten 2-5. De overgang van een plankton, vrijlevende modus van de groei van een biofilm toestand wordt vaak geassocieerd met ontwikkelingsprocessen. Een goed voorbeeld is de Gram-positieve bodem bacterie Bacillus subtilis, en dus een undomesticated stam dient als een robuust model organisme om de ontwikkelingsfasen die leiden tot de vorming van biofilm te bestuderen. In deze bacterie, beweeglijke cellen zichzelf te organiseren in het oog springende meercellige structuren die gespecialiseerde taken 4 uit te voeren. Een groep cellen, de matrix-producenten uitscheiden exopolysaccharides 6, het amyloïde proteïne TASA 7,8 en de oppervlaktehydrofobiciteit eiwit BSLA 9,10; die allemaal deelnemen aan de vergadering van de EPS 11-13.

Gezien de overvloed van biofilms in natuurlijke en antropogene niches en de vermeende fatale schade die ze kunnen veroorzaken, is er dringend behoefte aan manieren om hun vorming te voorkomen vinden. Kleinmoleculige remmers kunnen helpen bij het ontdekken van nieuwe regulatorische ketens, enzymen en structurele eiwitten betrokken bij biofilmvorming, en daardoor inzicht in de complexe processen van meercellige Gemeenschapsopbouw promoten. Zoals B. subtilis is een goed bestudeerde model voor biofilmvorming 14,15, kan het worden gebruikt om de effecten van verschillende biofilminhibitoren beoordelen. Deze studie behandelt vier fundamentele methoden die sleutel voor het evalueren van de respons van biofilms te klein molecuul-remmers zijn. Eerst, zodat deze remmers een biofilm-specifiek doel, de afscheiding van het effect op plankton groei en het effect op biofilmvorming kritisch. De meeste antibacteriële middelen richten op cellen in hun planktonische groeifase, maar moleculen die de biofilm levensstijl richten op zijn zeldzaam. Bovendien, zoals moleculen die geen invloed plankton groei niet toxisch, ze kunnen de selectiedruk begunstiging antibiotica resistente mutanten 16 verminderen. Wanneer bijvoorbeeld biofilms worden behandeld met D-aminozuren of bepaalde andere celwand storende moleculen, ze ofwel verstoord of gedemonteerd, maar deze inhibitoren slechts licht beïnvloeden planktonische groei 12,17. Daarentegen veel antibiotica drastisch beïnvloeden plankton groei, aan little of geen effect op biofilmvorming 17.

Ten tweede, de oprichting van een consistent en robuust experimenteel kader om het effect van de kleine moleculen te bestuderen is cruciaal. We zagen dat het werkzame concentratiebereik van kleine molecule inhibitoren was gevoelig voor de voorkweek omstandigheden en de experimentele opstelling gebruikt om het effect van deze kleine molecule inhibitoren bestuderen. Verschillende rapporten, met name bestuderen B. subtilis onthulde variaties in het concentratietraject waarbij D-aminozuren remmen de vorming van pellicles – de drijvende bacteriële biofilms 12,17-19. De hier gepresenteerde resultaten suggereren dat de volgende factoren verantwoordelijk zijn voor verschillen in de actieve concentratiegebied: de pre-kweekomstandigheden (logaritmische 12,17 versus late stationaire groeifase 20), het gebruikte groeimedium in de pre-kweekomstandigheid (rijk, undefined [Luria bouillon, LB] versus gedefinieerd [mononatriumglutamaatglycerol, MSgg]), de verhouding inoculatie het bijzonder het verwijderen van de pre-kweekmedium voor enting. De temperatuur van statische huidje groei vertoonden een minder belangrijke rol in het activiteitsgebied van de kleine molecule inhibitor D-leucine, representant D-aminozuur gebruikt in deze studie.

Tenslotte, zodra de biofilms worden behandeld met specifieke biofilm remmers, robuuste en informatief zijn vereist om de effecten van deze inhibitoren op biofilm fitness karakteriseren. Hier twee methoden onafhankelijk karakteriseren van het effect van kleine molecule inhibitoren worden beschreven: (1) Het effect op individuele cellen binnen een biofilm kolonie en hun resistentie tegen antimicrobiële agentia. Cellen in biofilms algemeen beter bestand tegen antibiotica vergeleken met vrijlevende bacteriën 21-23. Hoewel dit fenomeen multifactorieel, werd het vermogen van de EPS antibiotische penetratie beperken vaak beschouwd als een aantrekkelijke verklaring 24 </sup>. Deze methode beoordeelt de overleving van vooraf vastgestelde biofilm cellen na blootstelling aan antibacteriële stoffen. (2) Het effect op de biofilm kolonie architectuur van de grote tot de kleine schaal. Biofilm kolonies worden gekenmerkt door hun driedimensionale structuur en de aanwezigheid van de EPS. Gebruik scanning elektronenmicroscopie, kunnen veranderingen in de celmorfologie, biofilm kolonie structuur en architectuur en overvloed van het EPS worden gevisualiseerd door de grote (mm) de kleine schaal (micrometer).

Protocol

1. beoordeling van het effect van kleine molecule inhibitoren op Pellicle en biofilm Colony Formation Bereid een 2x oplossing van toegezegde biofilm inducerende MSgg medium 25 zonder calciumchloride en ijzer (III) chloride hexahydraat. Na filter sterilisatie, voeg de calciumchloride. Het medium is direct gereed en kan bij 4 ° C worden bewaard in het donker. Maak de 1x MSgg verdunning op de dag van het experiment. Verdun het 2x MSgg medium tot 1x met steriel gedestilleerd water (…

Representative Results

Het vlies test is een methode om de sterk gereguleerd en dynamische processen te bestuderen B. subtilis multicellulariteit. Daarnaast wordt het vlies assay geschikt voor een reeks van ofwel pre-startersvoorwaarden of klein molecuul concentraties getest in een enkele celkweek multidish plaat in één experiment. Echter, B. subtilis pellicule formatie is gevoelig voor de voorkweek omstandigheden (bijvoorbeeld groeimedium van de voorkweek en groeifase), de inoculatie verhouding en het verwijderen…

Discussion

Bacillus subtilis vormen robuust en zeer gestructureerd biofilms zowel in vloeibare (pellicles) en op vast medium (kolonies). Daarom dient het als een ideaal model organisme met het werkingsmechanisme van bepaalde biofilminhibitoren karakteriseren. Op vaste media, cellen vormen meercellige structuren met onderscheidende kenmerken die niet duidelijk in pellicles, zoals rimpels straalt van het centrum naar de rand. Zo pellicles en kolonies zijn complementair systemen om B. te studeren subtilis m…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Electron microscope imaging was conducted at the Electron Microscopy Unit of the Weizmann Institute of Science, supported in part by the Irving and Cherna Moskowitz Center for Nano and Bio-Nano Imaging. This research was also supported by the ISF I-CORE grant 152/1, Mr. and Mrs. Dan Kane, Ms. Lois Rosen, by a Yeda-Sela research grant, by the Larson Charitable Foundation, by Ruth and Herman Albert Scholars Program for New Scientists, by the Ilse Katz Institute for Materials Sciences and Magnetic Resonance Research grant, by the Ministry of Health grant for alternative research methods, and by the France-Israel Cooperation – Maimonide-Israel Research Program. IKG is a recipient of the Rowland and Sylvia Career Development Chair.

Materials

Luria Broth, Lennox Difco 240230
Bacto Agar Difco 214010
potassium phosphate monobasic  Sigma, 136.09 g/mol P0662-500G
potassium phosphate dibasic  Fisher Scientific, 174.18 g/mol BP363-1
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Fisher Scientific, 209.27 g/mol BP308-500
magnesium chloride hexahydrate  Merck, 203.30 g/mol  1.05833.0250
calcium chloride anhydrous J.T. Baker, 110.98 g/mol 1311-01
manganese(II) chloride tetrahydrate Sigma, 197.91 g/mol 31422-250G-R
iron(III) chloride hexahydrate  Sigma, 270.30 g/mo) F2877-500G
zinc chloride anhydrous  Acros Organics, 136.29 g/mol 424592500
thiamine hydrochloride Sigma, 337.27 g/mol T1270-100G
L-tryptophan Fisher Scientific, 204.1 g/mol BP395-100
L-phenylalanine Sigma, 165.19 g/mol P5482-100G
L-threonine Sigma, 119.12 g/mol T8625-100G
glycerol anhydrous Bio-Lab Itd 712022300
L-glutamic acid monosodium salts hydrate  Sigma, 169.11 g/mol G1626-1KG
D-leucine Sigma, 169.11 g/mol 855448-10G
ethanol anhydrous Gadot 830000054
razor blade Eddison NA
circular cellulose filter papers Whatman, 90 mm 1001-090
glutaraldehyde EMS (Electron Micoscopy Science), 25% in water 16220
paraformaldehyde  EMS, 16% in water 15710
sodium cacodylate Merck, 214.05 g/mol  8.2067
calcium chloride 2-hydrate Merck, 147.02 g/mol  1172113
stub-aluminium mount EMS, sloted head 75230
carbon adhesive tape EMS 77825-12
Shaker 37°C New Brunswick Scientific Innowa42 NA
Centrifuge Eppendorf table top centrifuge 5424 NA
Digital Sonifier, Model 250, used with Double Step Microtip Branson NA
Incubator 30 °C Binder NA
Incubator 23 °C Binder NA
Filter System, 500 ml, polystyrene Cornig Incorporated NA
Rotary Shaker – Orbitron Rotatory II Boekel NA
S150 Sputter Coater  Edwards NA
CPD 030 Critical Point Dryer BAL-TEC NA
Environmental Scanning Electron Microscope XL30 ESEM FEG Philips (FEI) NA

References

  1. Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).
  2. Stoodley, P., Sauer, K., Davies, D. G., Costerton, J. W. Biofilms as complex differentiated communities. Annu Rev Microbiol. 56, 187-209 (2002).
  3. Miller, M. B., Bassler, B. L. Quorum sensing in bacteria. Annu Rev Microbiol. 55, 165-199 (2001).
  4. Aguilar, C., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. Thinking about Bacillus subtilis as a multicellular organism. Curr Opin Microbiol. 10, 638-643 (2007).
  5. Kolter, R., Greenberg, E. P. Microbial sciences: the superficial life of microbes. Nature. 441, 300-302 (2006).
  6. Kearns, D. B., Chu, F., Branda, S. S., Kolter, R., Losick, R. A master regulator for biofilm formation by Bacillus subtilis. Mol Microbiol. 55, 739-749 (2005).
  7. Branda, S. S., Chu, F., Kearns, D. B., Losick, R., Kolter, R. A major protein component of the Bacillus subtilis biofilm matrix. Mol Microbiol. 59, 1229-1238 (2006).
  8. Romero, D., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. Amyloid fibers provide structural integrity to Bacillus subtilis biofilms. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 2230-2234 (2010).
  9. Kobayashi, K., Iwano, M. BslA(YuaB) forms a hydrophobic layer on the surface of Bacillus subtilis biofilms. Mol Microbiol. 85, 51-66 (2012).
  10. Hobley, L., et al. BslA is a self-assembling bacterial hydrophobin that coats the Bacillus subtilis biofilm. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 13600-13605 (2013).
  11. Romero, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. An accessory protein required for anchoring and assembly of amyloid fibres in B. subtilis biofilms. Mol Microbiol. 80, 1155-1168 (2011).
  12. Kolodkin-Gal, I., et al. D-amino acids trigger biofilm disassembly. Science. 328, 627-629 (2010).
  13. Chan, Y. G., Kim, H. K., Schneewind, O., Missiakas, D. The capsular polysaccharide of Staphylococcus aureus is attached to peptidoglycan by the LytR-CpsA-Psr (LCP) family of enzymes. J Biol Chem. 289, 15680-15690 (2014).
  14. Mielich-Suss, B., Lopez, D. Molecular mechanisms involved in Bacillus subtilis biofilm formation. Environ Microbiol. 17, 555-565 (2014).
  15. Cairns, L. S., Hobley, L., Stanley-Wall, N. R. Biofilm formation by Bacillus subtilis: new insights into regulatory strategies and assembly mechanisms. Mol Microbiol. 93, 587-598 (2014).
  16. Chen, M., Yu, Q., Sun, H. Novel strategies for the prevention and treatment of biofilm related infections. Int J Mol Sci. 14, 18488-18501 (2013).
  17. Bucher, T., Oppenheimer-Shaanan, Y., Savidor, A., Bloom-Ackermann, Z., Kolodkin-Gal, I. Disturbance of the bacterial cell wall specifically interferes with biofilm formation. Environ Microbiol Rep. 7, 990-1004 (2015).
  18. Sarkar, S., Pires, M. M. D-Amino acids do not inhibit biofilm formation in Staphylococcus aureus. PLoS One. 10, e0117613 (2015).
  19. Wei, W., Bing, W., Ren, J., Qu, X. Near infrared-caged D-amino acids multifunctional assembly for simultaneously eradicating biofilms and bacteria. Chem Commun (Camb). 51, 12677-12679 (2015).
  20. Leiman, S. A., et al. D-amino acids indirectly inhibit biofilm formation in Bacillus subtilis by interfering with protein synthesis. J Bacteriol. 195, 5391-5395 (2013).
  21. Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
  22. Davies, D. Understanding biofilm resistance to antibacterial agents. Nat Rev Drug Discov. 2, 114-122 (2003).
  23. Olsen, I. Biofilm-specific antibiotic tolerance and resistance. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 34, 877-886 (2015).
  24. Tseng, B. S., et al. The extracellular matrix protects Pseudomonas aeruginosa biofilms by limiting the penetration of tobramycin. Environ Microbiol. 15, 2865-2878 (2013).
  25. Branda, S. S., Gonzalez-Pastor, J. E., Ben-Yehuda, S., Losick, R., Kolter, R. Fruiting body formation by Bacillus subtilis. Proc Natl Acad Sci USA. 98, 11621-11626 (2001).
  26. Holscher, T., et al. Motility, Chemotaxis and Aerotaxis Contribute to Competitiveness during Bacterial Pellicle Biofilm Development. J Mol Biol. 427, 3695-3708 (2015).
  27. Bray, D. . Methods in Biotechnology. 13, 235-243 (2000).
  28. Ensikat, H. J., Ditsche-Kuru, P., Barthlott, W. . Scanning electron microscopy of plant surfaces: simple but sophisticated methods for preparation and examination. 1, 248-255 (2010).
  29. Hayat, M. A. . Principles and techniques of scanning electron microscopy: Biological applications. 2, (1976).
  30. Schatten, H. . Scanning Electron Microscopy for the Life Sciences. , (2013).
  31. Bridier, A., Meylheuc, T., Briandet, R. Realistic representation of Bacillus subtilis biofilms architecture using combined microscopy (CLSM, ESEM and FESEM). Micron. 48, 65-69 (2013).
  32. Boyde, A., MacOnnachie, E. Volume changes during preparation of mouse embryonic tissue for scanning electron microscopy. SCANNING. 2, 149-163 (1979).
  33. Yao, Z., Kahne, D., Kishony, R. Distinct single-cell morphological dynamics under beta-lactam antibiotics. Mol Cell. 48, 705-712 (2012).
  34. Epstein, A. K., Pokroy, B., Seminara, A., Aizenberg, J. Bacterial biofilm shows persistent resistance to liquid wetting and gas penetration. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 995-1000 (2011).
  35. Vlamakis, H., Chai, Y., Beauregard, P., Losick, R., Kolter, R. Sticking together: building a biofilm the Bacillus subtilis way. Nat Rev Microbiol. 11, 157-168 (2013).
  36. Shemesh, M., Chai, Y. A combination of glycerol and manganese promotes biofilm formation in Bacillus subtilis via histidine kinase KinD signaling. J Bacteriol. 195, 2747-2754 (2013).
  37. Kolodkin-Gal, I., et al. Respiration control of multicellularity in Bacillus subtilis by a complex of the cytochrome chain with a membrane-embedded histidine kinase. Genes Dev. 27, 887-899 (2013).
  38. Oppenheimer-Shaanan, Y., et al. Spatio-temporal assembly of functional mineral scaffolds within microbial biofilms. npj Biofilms and Microbiomes. 2, 15031 (2016).
  39. Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry. J Vis Exp. , e3796 (2012).
  40. Bogino, P. C., Oliva Mde, L., Sorroche, F. G., Giordano, W. The role of bacterial biofilms and surface components in plant-bacterial associations. Int J Mol Sci. 14, 15838-15859 (2013).
  41. Fratamico, P. M., Annous, B. A., Guenther, N. W. . Biofilms in the Food and Beverage Industires. 1, (2009).
  42. Gao, G., et al. Effect of biocontrol agent Pseudomonas fluorescens 2P24 on soil fungal community in cucumber rhizosphere using T-RFLP and DGGE. PLoS One. 7, e31806 (2012).
  43. Chen, Y., et al. Biocontrol of tomato wilt disease by Bacillus subtilis isolates from natural environments depends on conserved genes mediating biofilm formation. Environ Microbiol. 15, 848-864 (2013).
  44. Bryers, J. D. Medical biofilms. Biotechnol Bioeng. 100, 1-18 (2008).
  45. Logan, B. E. Exoelectrogenic bacteria that power microbial fuel cells. Nat Rev Microbiol. 7, 375-381 (2009).
  46. Nevin, K. P., Woodard, T. L., Franks, A. E., Summers, Z. M., Lovley, D. R. Microbial electrosynthesis: feeding microbes electricity to convert carbon dioxide and water to multicarbon extracellular organic compounds. MBio. 1, (2010).
  47. Torres, C. I., et al. A kinetic perspective on extracellular electron transfer by anode-respiring bacteria. FEMS Microbiol Rev. 34, 3-17 (2010).
  48. Li, J., Wang, N. Foliar application of biofilm formation-inhibiting compounds enhances control of citrus canker caused by Xanthomonas citri subsp. citri. Phytopathology. 104, 134-142 (2014).
  49. Okegbe, C., Price-Whelan, A., Dietrich, L. E. Redox-driven regulation of microbial community morphogenesis. Curr Opin Microbiol. 18, 39-45 (2014).
  50. Mann, E. E., Wozniak, D. J. Pseudomonas biofilm matrix composition and niche biology. FEMS Microbiol Rev. 36, 893-916 (2012).
  51. Bouffartigues, E., et al. Sucrose favors Pseudomonas aeruginosa pellicle production through the extracytoplasmic function sigma factor SigX. FEMS Microbiol Lett. 356, 193-200 (2014).
  52. Wu, C., Lim, J. Y., Fuller, G. G., Cegelski, L. Quantitative analysis of amyloid-integrated biofilms formed by uropathogenic Escherichia coli at the air-liquid interface. Biophys J. 103, 464-471 (2012).
  53. Serra, D. O., Richter, A. M., Hengge, R. Cellulose as an Architectural Element in Spatially Structured Escherichia coli Biofilms. J Bacteriol. 195, 5540-5554 (2013).

Play Video

Cite This Article
Bucher, T., Kartvelishvily, E., Kolodkin-Gal, I. Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors. J. Vis. Exp. (116), e54612, doi:10.3791/54612 (2016).

View Video