Mesenteric afferent nerves convey information from the gastrointestinal tract towards the brain regarding normal homeostasis as well as pathophysiology. Gastrointestinal afferent nerve activity can be assessed by mounting isolated intestinal segments with attached afferent nerves into an organ bath, isolating the nerve, and assessing basal as well as stimulated activity.
Афферентные нервы не только передают информацию относительно нормальной физиологии, но и сигнал нарушенного гомеостаза и патофизиологические процессы различных органов и систем от периферии к центральной нервной системе. Таким образом, повышенная активность или «сенсибилизация» брыжеечных афферентных нервов было выделено важную роль в патофизиологии висцеральной гиперчувствительностью и брюшных болевых синдромов.
Мезентериальный афферентного нерва активность может быть измерена в пробирке в изолированной кишечного сегмента , который установлен в ванночку специально построенном и из которого выделяют чревного нерва, что позволяет исследователям непосредственно оценить нервную активность , примыкающий к желудочно – кишечного сегмента. Активность может быть записан на базовой линии в стандартных условиях, во время вздутие сегмента или после добавления фармакологических соединений, поставляемых intraluminally или serosally. Этот метод позволяетисследователь легко изучить влияние препаратов, нацеленных на периферическую нервную систему в контрольных образцах; кроме того, она предоставляет важную информацию о том, как нейронная активность изменяется во время болезни. Следует отметить , однако , что измерение афферентный нейронную огневую активность только составляет одну ретрансляционную станцию в комплексе нейронального сигнального каскада, и исследователи должны иметь в виду , чтобы не упускать из виду нейронную активность на других уровнях (например, ганглии задних корешков, спинного мозга или центральной нервной системы ) для того, чтобы полностью уяснения сложную нейронную физиологию в отношении здоровья и болезни.
Часто используемые приложения включают в себя изучение активности нейронов в ответ на введение липополисахарида и изучение афферентной нервной активности на животных моделях синдрома раздраженного кишечника. В более поступательным подходе сегмент кишечного изолированный мышь может подвергаться ободочной супернатанатах пациентов с СРК. Кроме того, модификацияэтой техники было недавно показано, что применимо в ободочной образцов человека.
Сенсорная сигнализация и восприятие боли представляет собой сложный процесс, который является результатом сложной взаимосвязи между афферентных нервов, нейронов спинного мозга, восходящей и нисходящей облегчающее и ингибирующих путей и нескольких различных областях мозга. Таким образом, изменения в одном или нескольких из этих уровней может привести к сенсорной сигнализации измененном и висцеральной боли при болезненных состояниях. Для того, чтобы изучить все эти различные аспекты нескольких методов сенсорной сигнализации были разработаны в диапазоне от экспериментов одиночных клеток (например, изображений кальция на нейроны) до целых животных моделях (например, поведенческие реакции , такие как ответ висцеромоторный). Техника , описанная в данной статье позволяет исследователям конкретно оценивать афферентную активность нерва в пробирке из изолированного сегмента тонкой кишки или толстой кишки у грызунов. Короче говоря, изолированный желудочно-кишечный сегмент (обычно тощей или толстой кишки) установлен в регистрирующей камере, специально построенном перфузией физиологическим KРЭП решение. Внутренностный нерв отсекали и соединен с электродом, позволяющим регистрацию афферентной активности нейронов в висцеральных или тазовых афферентных нервов. Нервные активность может быть записана базально или в ответ на повышение внутрипросветного давления и / или фармакологические соединения , которые могут быть применены либо непосредственно в камеру для записи (serosally), или с помощью внутриполостной перфузату ( через слизистую оболочку) , чтобы оценить их воздействие на афферентную разряда 1-6 , Следует отметить, что Висцеральные нервы также содержат эфферентные волокна и viscerofugal афферентов в дополнение к сенсорному афферентов. Одним из основных преимуществ экс естественных условиях висцеральной записи нерва является тот факт , что исследователи могут количественно нервную активность без модуляции или входного сигнала от центральной нервной системы, позволяя изучать прямое действие локально применяемых соединений на нервную активность. Кроме того, мониторинг жизненно важных параметров, как это необходимо , используя подход , в естественных условиях (см ниже), равно по более актуальной. В пробирке внутренностный записи наконец -то гораздо меньше времени , чем его коллега в естественных условиях.
Афферентный нейронная активность в ответ на другие раздражители, такие как слизистые оболочки поглаживание, зондирующих с помощью волосков фон Фрея или растягивающих сегмента, могут быть изучены в модифицированной экспериментальной установки, в которых кишечная ткань возлагали и разложен в продольном направлении (что, в отличие от наша установка , используя неповрежденный сегмент), как это было описано в предыдущем выпуске 7,8. Кроме того, совсем недавно, методика была описана для изучения ободочной активации афферентных нервных в самой кишечной стенки через визуализации кальция, снова используя скована, продольно открыт сегмент 9.
Альтернативная версия этой методики в естественных условиях состоит из измерения нейронную активацию вблизи входа в афферентной в спинной мозг. Короче говоря, седативные животное помещается в положении лежа, еxposing пояснично – крестцового спинного мозга , к которому афферентный нерв процентных проектов посредством ламинэктомии, строя парафином заполненные хорошо используя кожу разреза и драпировка спинной корешок над платиновым биполярного электрода 10,11. Этот метод, кроме того, позволяет исследователям характеризовать волокна, основанные на их скорости проводимости, и различают немиелинизированные С-волокна из тонко миелиновых Aδ-волокон. Кроме того, спинные корешки исключительно содержат сенсорные афферентные волокна, в отличие от неоднозначного афферентные и эфферентные висцеральных нервов, упомянутых ранее.
Запись афферентного разряда нерва в пробирке из изолированных сегментов кишечника также может быть сделано с использованием человеческих образцов, как две исследовательские группы независимо друг от друга , опубликованных первый в человеке рукописи записи ободочной афферентную активность нервной системы у человека резекции образцов 12,13. Реализация этого метода может привести к более легко translatiна мышиных данных в гуманной состоянии, и может позволить исследователям легко идентифицировать наркотики с таргетингом на сенсибилизированные чувствительного нерва. Клиническое значение , характеризующее афферентного нерва активности, а также открытие новых терапевтических реагентов , которые нацелены на непомерную афферентную нервную активность, был подробно обсужден многими специалистами в области 14-19.
Вышеупомянутая технология в пробирке дополняет более широко известный в измерении естественных условиях афферентной нервной активности. Во время измерения нейрональной активности в естественных условиях, нервной активности может быть измерено непосредственно в седации животного , в течение которого сегмент интереса, была идентифицирована и впоследствии интубацию, и жидкий парафин заполненные хорошо строится с помощью брюшной стенки и кожи грызуна 20. Афферентных нервов, представляющий интерес, а затем идентифицированы, разрезали и помещали на биполярного платинового электрода, что позволяет нейронные активности проводились измереният. Этот метод позволяет исследователю модулировать афферентную нервную активность в живых хотя и седативных животных; как таковой, можно изучить нейронную активность в ответ на помехах, таких как полостной растяжением или внутривенного введения соединения.
Поступательное исследование в настоящее время в основном сосредоточена на применении надосадочных человека , полученных (например., Из ободочной биопсий, культивируемых мононуклеарных клеток периферической крови и т.п.) на тощей кишки и / или толстой афферентов мыши 21,22. Исследователи могут непосредственно применять супернатантов либо в ванночку или в просвете решение, которое perfuses сегмент кишечника, так что дифференциальные эффекты серозной против применения слизистых оболочек могут быть изучены на афферентного разряда нерва. Таким образом, было показано, что ободочной слизистой биопсии supernatans у пациентов с синдромом раздраженного кишечника может вызвать повышенную чувствительность мыши в ободочной афферентов, морской свинки субмукозных нейронов и мыши спинного корняганглиозные нейроны 21,23,24.
И, наконец, запись нейронную активность не ограничивается мезентериальные и / или тазовой нейронов, иннервирующих желудочно-кишечного тракта. Другие продемонстрировали , что нервные записи могут быть выполнены в афферентов подачи коленного сустава 25, тогда как другие охарактеризовали мочевой пузырь афферентный нервную активность , а также 26-28, и показали , что тазовые афферентов из мочевого пузыря, а также желудочно – кишечного тракта сходятся, что может привести к нейрональной перекрестные помехи 29.
Протокол , используемый в данной работе описан воспроизводимый лабораторной техники для изучения брыжеечной нерва активность афферентный у грызунов, которые используются в нашей группе и других 3,4,7,8,12,20,21,31. Критические шаги в рамках протокола включают быструю изоляцию ткани, ст…
The authors have nothing to disclose.
SN performed the experiments described above, performed the data analysis and drafted the manuscript. AD and JDM implemented the technique at our research facilities and aided in the data analysis. HC aided in performing the experiments. WJ, CK and DG assisted in implementing the afferent measurement technique in our lab, the data analysis and interpretation of the results. SF, JDM and BDW designed the study. All authors critically read and approved the final manuscript. SN is an aspirant of the Fund for Scientific Research (FWO), Flanders (11G7415N). This work was supported financially by the FWO (G028615N and G034113N).
sodium chloride (NaCl) | VWR Chemicals | 27,810,295 | compound Krebs solution |
potassium chloride (KCl) | Acros organics | 196770010 | compound Krebs solution |
sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) | VWR Chemicals | 1,063,461,000 | compound Krebs solution |
sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | 1,063,291,000 | compound Krebs solution |
magnesium sulfate (MgSO4) | Merck | 1,058,861,000 | compound Krebs solution |
calcium chloride (CaCl2) | Merck | 23,811,000 | compound Krebs solution |
D-glucose | VWR Chemicals | 1011175P | compound Krebs solution |
Distilled water | compound Krebs solution | ||
PVC tubing | Scientific Laboratory Supplies | The intestinal segment should be mounted over PVC tubing | |
Silicone tubing | Scientific Laboratory Supplies | The rest of the tubing, ideally silicone-based – more easily dislodging of debris in the tubing | |
Silk thread | Pearsall Limited | 10B15S220 | Attachment of the segment over the PVC tubing |
Syringe driver | Harvard Apparatus | 55-2222 | Intraluminal infusion of Krebs |
Binocular – including 10x magnification in oculair | Zeiss STEMI 2000 | Optimal visualization for the dissection of the afferent nerve | |
Homeothermic Blanket Control Unit | Harvard Apparatus | 507214 | Heating of the organ chamber |
Custom made organ bath with Sylgard covered bottom | |||
Spike2 software | Recording and analysis of the data | ||
Insect pins, 500 pieces, stainless steel, diameter 0.2 mm | Austerlitz insect pins minutiens | Dissection of the afferent nerve | |
Tweezer Dumont #5 inox 11cm | World Precision Instrument | 500341 | Dissection of the afferent nerve |
Scissors, spring, 14 cm | World Precision Instrument | 15905 | Dissection of the afferent nerve |
DB digitimer | NL 108T2/10 | pressure transducer | |
Micromanipulator | Narishige | M-3333 | 3D manipulation of the suction electrode |
Micromanipulator | X-4 rotating block | 3D manipulation of the suction electrode | |
Micromanipulator | GJ-8 magnetic stand | 3D manipulation of the suction electrode | |
LightSource | Euromex Microscopes Holland EK-1 | Optimal visualization for the dissection of the afferent nerve | |
CED 1401 Recording Apparatus | Recording of afferent nerve activity | ||
Humbug 50/60Hz Noise Eliminator | Quest Scientific Instruments | Elimination of background noise | |
Infusion Pump | Gibson Minipuls 2 | Infusion of the organ chamber in which the segment is mounted | |
Microelectrode Holder Half Cells 1.5 mm | World Precision Instrument | MEH2SW | Suction electrode for isolation of the afferent fiber |
Borosilicate Glass Capillaries, 300 pc; 1.5/0.84 OD/ID | World Precision Instrument | 1B150-4 | Capillary for the isolation of the afferent nerve |