Mesenteric afferent nerves convey information from the gastrointestinal tract towards the brain regarding normal homeostasis as well as pathophysiology. Gastrointestinal afferent nerve activity can be assessed by mounting isolated intestinal segments with attached afferent nerves into an organ bath, isolating the nerve, and assessing basal as well as stimulated activity.
Afferenten Nerven nicht nur Informationen über die normale Physiologie vermitteln, sondern auch die Signal gestörter Homöostase und pathophysiologischen Prozessen der verschiedenen Organsysteme von der Peripherie in Richtung des zentralen Nervensystems. Als solche hat die erhöhte Aktivität oder "Sensibilisierung" von mesenterischen afferenten Nerven wurde eine wichtige Rolle in der Pathophysiologie der viszerale Hypersensitivität und Bauchschmerzsyndromen zugeordnet.
Mesenteriale afferenten Nerven – Aktivität in vitro in einem isolierten Darm-Segment gemessen werden , die in einem eigens errichteten Organbad montiert ist und aus dem die Splanchnicus isoliert ist, so dass die Forscher direkt Nervenaktivität neben dem Magen – Darm – Segment zu beurteilen. Aktivität kann in standardisierten Bedingungen an der Basislinie aufgezeichnet werden, während der Aufblähung des Segments oder nach der Zugabe von pharmakologischen Verbindungen geliefert intraluminal oder serös. Diese Technik ermöglichtdie Forscher leicht die Wirkung von Medikamenten untersuchen das periphere Nervensystem in Kontrollproben ausgerichtet sind; Außerdem liefert es wichtige Informationen darüber, wie die neuronale Aktivität während der Krankheit verändert. Es sollte jedoch beachtet werden , dass nur afferente neuronale Aktivität Messung der Aktivität einer Relaisstation in der komplexen neuronalen bildet Signalkaskade, und Forscher sollten bedenken , nicht auf die neuronale Aktivität auf anderen Ebenen (zB Dorsalwurzelganglien, Rückenmark oder das zentrale Nervensystem übersehen ), um die komplexen neuronalen Physiologie in Gesundheit und Krankheit vollständig aufzuklären.
Häufig verwendete Anwendungen umfassen die Untersuchung der neuronalen Aktivität in Reaktion auf die Verabreichung von Lipopolysaccharid und das Studium der afferenten Nerven-Aktivität in Tiermodellen von Reizdarmsyndrom. In einem translationalen Ansatz kann der isolierten Maus intestinalen Segment colonic Überständen von IBS-Patienten ausgesetzt werden. Weiterhin ist eine Modifikationdieser Technik in menschlichen Kolon-Proben vor kurzem anwendbar erwiesen hat.
Sensory-Signalisierung und die Schmerzwahrnehmung ist ein komplexer Prozess, der zwischen afferenten Nerven, Rücken Neuronen, auf- und absteigende fazilitierenden und hemmenden Bahnen und verschiedene Hirnregionen aus einem komplizierten Zusammenspiel ergibt. Als solche Änderungen an einer oder mehreren dieser Stufen in veränderte sensorische Signalgebung und viszeralen Schmerzen bei Krankheitszuständen führen können. Um all diese verschiedenen Aspekte der sensorischen Signal mehrere Techniken studieren wurden von Einzelzellexperimenten entwickelt Bereich (zB Kalzium – Imaging auf Neuronen) auf ganze Tiermodellen (zB Verhaltensreaktionen wie die viszeromotorische Antwort). Die Technik , die in diesem Papier beschrieben ermöglicht es den Forschern , um spezifisch zuführenden Nervenaktivität in vitro aus einem isolierten Segment des Dünndarms oder Dickdarms bei Nagetieren zu bewerten. Kurz gesagt, ein isoliertes Magen-Darm-Segment (in der Regel Jejunum oder Kolon) in einem eigens errichteten Aufnahmekammer mit einer physiologischen K durchbluteten montiertrebs Lösung. Der Splanchnicus wird freipräpariert und mit einer Elektrode verbunden Registrierung von afferenten neuronalen Aktivität in splanchnic oder Becken afferenten Nerven ermöglicht. Nervenaktivität kann basal oder als Reaktion auf zunehmenden intraluminalen Druck und / oder pharmakologische Verbindungen aufgezeichnet werden , die entweder direkt in die Aufnahmekammer eingesetzt werden kann (serös), oder über die intraluminale Perfusat (mukosal) ihre Wirkung auf afferenten Entladung zu bewerten 1-6 . Zu beachten ist, splanchnici enthalten auch Efferenzen und viscerofugal afferents zusätzlich zu den sensorischen Afferenzen. Einer der wichtigsten Vorteile von ex vivo Splanchnicus Aufnahme ist die Tatsache , dass die Forscher die Nervenaktivität ohne Modulation oder Input aus dem zentralen Nervensystem zu quantifizieren, so dass man die direkte Wirkung von lokal applizierten Verbindungen auf die Nervenaktivität zu untersuchen. Weiterhin Überwachung von Vitalparametern, wie notwendig ist , die in vivo – Ansatz (siehe unten), ist no mehr relevant. In – vitro – splanchnic Aufnahme ist schließlich viel weniger zeitaufwendig als die in – vivo – Pendant.
Zuführenden neuronalen Aktivität in Reaktion auf andere Reize, wie Schleimhaut Streicheln, Sondieren mittels von Frey Haare oder Dehnen des Segments können in einer modifizierten Versuchsaufbau untersucht werden, in denen das Darmgewebe ist festgenagelt und in Längsrichtung geöffnet (die im Gegensatz zu unser Setup ein intaktes Segment) verwenden, wie es in einer früheren Ausgabe 7,8 beschrieben wurde. Darüber hinaus wurde erst kürzlich eine Technik beschrieben colonic afferenten Nervenaktivierungs in der Kolonwand selbst über Calcium Bildgebung zu studieren, wieder festgenagelt Verwendung longitudinal geöffnet Segment 9.
Eine alternative Version dieser in vivo – Technik besteht aus neuronale Aktivierung in der Nähe der Eintrag des afferenten in das Rückenmark zu messen. Kurz gesagt, wird die sedierten Tier in der Bauchlage, e platziertxposing lumbosakralen Rückenmark ein Paraffin gefüllt und mit der Haut des Einschnitts an dem die afferente von Interesse Projekte durch Laminektomie, den Bau und die dorsale rootlet über eine Platin bipolaren Elektrode 10,11 drapieren. Diese Technik erlaubt zudem Forscher Fasern zu charakterisieren basierend auf ihrer Leitungsgeschwindigkeit und unterscheiden unmyelinated C-Fasern, die aus dünn myelinisierten A & dgr-Fasern. Weiterhin dorsalen Wurzelfasern enthalten ausschließlich sensorischen afferenten Fasern, im Gegensatz zu den gemischten und abführenden splanchnici zuvor erwähnt.
Aufnahme afferenten Nervenentladung in vitro aus isolierten Darmsegmente können auch unter Verwendung von humanen Proben durchgeführt werden, als zwei Forschergruppen unabhängig veröffentlicht first-in-man Manuskripte Kolon afferenten Nervenaktivität in menschlichen Resektionsproben 12,13 Aufnahme. Die Umsetzung dieser Technik in einem mehr führen könnte leicht translatiauf der Maus-Daten an den humanen Zustand und könnte den Forschern ermöglichen, auf einfache Weise Medikamente zu identifizieren, die sensibilisiert sensorischen Nerven Targeting. Die klinische Bedeutung der zuführenden Nervenaktivität zu charakterisieren, sowie die Entdeckung neuer therapeutischer Reagenzien , die exorbitant afferenten Nervenaktivität Ziel, wurde von vielen Experten auf dem Gebiet 14-19 ausführlich diskutiert.
Die zuvor genannte In – vitro – Technik ergänzt die am häufigsten in vivo – Messung von afferenten Nervenaktivität bekannt. Während in vivo kann neuronalen Aktivitätsmessung, Nervenaktivität direkt im sediert Tieres gemessen werden , während der das interessierende Segment identifiziert wird und anschließend intubiert und ein flüssiges Paraffin gefüllt und wird mit Hilfe der Bauchdecke und die Haut 20 des Nagetier konstruiert. Der afferente von Interesse wird dann identifiziert, geschnitten und auf einer bipolaren Platinelektrode gelegt, die neuronale Aktivität ermöglicht Messung!t. Diese Technik erlaubt es dem Forscher afferenten Nervenaktivität zu modulieren, wenn auch sediert Tiere in lebenden; als solche kann man reagieren neuronale Aktivität zu Störungen wie luminalen Distension oder intravenöser Verabreichung einer Verbindung studieren.
Translationale Forschung heutzutage konzentriert sich hauptsächlich auf die Anwendung von Menschen stammenden Überstände (z. B. aus Kolonbiopsien, kultivierten peripheren mononukleären Blutzellen, etc.) auf jejunal und / oder Kolon – Maus Afferenzen 21,22. Die Forscher können direkt Stände gelten entweder in das Organ Bad oder in die intraluminale Lösung, die das Darmsegment perfundiert, so dass die unterschiedlichen Wirkungen von serösen gegen Schleimhaut-Anwendung kann auf afferenten Nervenentladung untersucht werden. Als solches war es, dass Kolon-Schleimhaut-Biopsie supernatans von Patienten mit Reizdarmsyndrom gezeigt, Überempfindlichkeit in Maus Kolon Afferenzen, Meerschweinchen submucöse Neuronen und Maus dorsalen Wurzel verursachenGanglionneuronen 21,23,24.
Schließlich wird die neuronale Aktivität der Aufnahme nicht auf die mesenterialen eingeschränkt und / oder Becken Neuronen Innervation des Magen-Darm-Trakt. Andere haben gezeigt, dass Nerven Aufnahmen können in afferents Versorgung des Kniegelenks 25 durchgeführt werden, während andere Blase afferenten Nervenaktivität gekennzeichnet sind und 26-28, und zeigte , dass Becken Afferenzen aus der Blase als auch den Magen – Darm – Trakt zusammenlaufen, was möglicherweise zu neuronalen Übersprechens 29.
Das Protokoll in diesem Dokument beschreibt eine reproduzierbare Labortechnik mesenteric afferenten Nervenaktivität bei Nagetieren zu studieren als 3,4,7,8,12,20,21,31 von unserer Gruppe und andere. Kritische Schritte innerhalb des Protokolls gehören die schnelle Isolierung des Gewebes, das Streben des Nervenstrang in die Saugelektrode und die angemessene "Versiegelung" der Glaskapillare aus dem Organbad durch umgebende Fettgewebe in die Kapillare abgesaugt. Die Öffnung der Glaskapillare sollte g…
The authors have nothing to disclose.
SN performed the experiments described above, performed the data analysis and drafted the manuscript. AD and JDM implemented the technique at our research facilities and aided in the data analysis. HC aided in performing the experiments. WJ, CK and DG assisted in implementing the afferent measurement technique in our lab, the data analysis and interpretation of the results. SF, JDM and BDW designed the study. All authors critically read and approved the final manuscript. SN is an aspirant of the Fund for Scientific Research (FWO), Flanders (11G7415N). This work was supported financially by the FWO (G028615N and G034113N).
sodium chloride (NaCl) | VWR Chemicals | 27,810,295 | compound Krebs solution |
potassium chloride (KCl) | Acros organics | 196770010 | compound Krebs solution |
sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) | VWR Chemicals | 1,063,461,000 | compound Krebs solution |
sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | 1,063,291,000 | compound Krebs solution |
magnesium sulfate (MgSO4) | Merck | 1,058,861,000 | compound Krebs solution |
calcium chloride (CaCl2) | Merck | 23,811,000 | compound Krebs solution |
D-glucose | VWR Chemicals | 1011175P | compound Krebs solution |
Distilled water | compound Krebs solution | ||
PVC tubing | Scientific Laboratory Supplies | The intestinal segment should be mounted over PVC tubing | |
Silicone tubing | Scientific Laboratory Supplies | The rest of the tubing, ideally silicone-based – more easily dislodging of debris in the tubing | |
Silk thread | Pearsall Limited | 10B15S220 | Attachment of the segment over the PVC tubing |
Syringe driver | Harvard Apparatus | 55-2222 | Intraluminal infusion of Krebs |
Binocular – including 10x magnification in oculair | Zeiss STEMI 2000 | Optimal visualization for the dissection of the afferent nerve | |
Homeothermic Blanket Control Unit | Harvard Apparatus | 507214 | Heating of the organ chamber |
Custom made organ bath with Sylgard covered bottom | |||
Spike2 software | Recording and analysis of the data | ||
Insect pins, 500 pieces, stainless steel, diameter 0.2 mm | Austerlitz insect pins minutiens | Dissection of the afferent nerve | |
Tweezer Dumont #5 inox 11cm | World Precision Instrument | 500341 | Dissection of the afferent nerve |
Scissors, spring, 14 cm | World Precision Instrument | 15905 | Dissection of the afferent nerve |
DB digitimer | NL 108T2/10 | pressure transducer | |
Micromanipulator | Narishige | M-3333 | 3D manipulation of the suction electrode |
Micromanipulator | X-4 rotating block | 3D manipulation of the suction electrode | |
Micromanipulator | GJ-8 magnetic stand | 3D manipulation of the suction electrode | |
LightSource | Euromex Microscopes Holland EK-1 | Optimal visualization for the dissection of the afferent nerve | |
CED 1401 Recording Apparatus | Recording of afferent nerve activity | ||
Humbug 50/60Hz Noise Eliminator | Quest Scientific Instruments | Elimination of background noise | |
Infusion Pump | Gibson Minipuls 2 | Infusion of the organ chamber in which the segment is mounted | |
Microelectrode Holder Half Cells 1.5 mm | World Precision Instrument | MEH2SW | Suction electrode for isolation of the afferent fiber |
Borosilicate Glass Capillaries, 300 pc; 1.5/0.84 OD/ID | World Precision Instrument | 1B150-4 | Capillary for the isolation of the afferent nerve |