We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.
Антитела к нейраминидазы (NA), второй самый распространенный белок на поверхности вируса гриппа, внести свой вклад в сторону защиты от гриппа. Традиционные методы измерения Н.А. ингибирования (NI) титры антител не практичны для рутинного серологического. Этот протокол описывает связанный с ферментом лектин анализа (ELLA), практический альтернативный метод для измерения титр NI, который выполняется в 96-луночные планшеты, покрытые большим гликопротеина субстратом, фетуина. NA отщепляет концевые сиаловой кислоты из фетуина, обнажая предпоследнюю сахара, галактозы. Арахисовое агглютининов (ПНК) является лектин со специфичностью к галактоза и, следовательно, степень десиалилирования может быть определена количественно с помощью конъюгированного с пероксидазой хрена, PNA-, с последующим добавлением хромогенного субстрата пероксидазы. Оптическая плотность, которая измеряется пропорциональна активности NA. Для измерения титра антител NI, серийные разведения сыворотки инкубируют при 37 ° CO / N на фетуина покрытием пластин с фиксированным количеством OF NA. Обратную самого высокого разведения сыворотки, что приводит к ≥50% -ное ингибирование активности NA обозначается как титр антител NI. ELLA предоставляет практический формат для рутинной оценки ответов антител человека после заражения гриппом или вакцинации.
Нейраминидазы (NA) представляет собой гликопротеин, экспрессируется на поверхности вирионов гриппа. Его активность фермента необходима для высвобождения вновь образованных вирусных частиц из инфицированных клеток 1,2. Антитела , которые ингибируют активность NA уменьшают вирусные титры и симптомы болезни на животных моделях 3 и коррелирует с устойчивостью к болезни у человека 4. Поэтому увеличение ингибирования NA (NI) титра после вакцинации может служить показателем эффективности вакцины, однако многие в прошлом гриппа исследования иммуногенности не включили эту конечную точку, потому что традиционный тест для измерения титров антител NI непрактичен для рутинного серологического.
Традиционный метод измерения титр NI основан на определения количества сиаловой кислоты , которая отщепляется от гликоконъюгатами по NA 1. Этот метод, который часто называют в качестве метода тиобарбитуровой кислоты (ТБК), использует опасные химические вещества для преобразования переменного тока сиаловойID к хромофора, что может быть определена количественно с помощью спектрофотометрии. Анализ не подходит для тестирования большого количества образцов, так как используются отдельные стеклянные трубки, что делает анализ громоздки. Миниатюризация анализа в 96 – луночные планшеты , обеспечивает более практичный формат 5, тем не менее до сих пор этот анализ требует использования токсичных химических веществ , и , следовательно , не является идеальным.
Альтернативный анализ для измерения титра антител NI был разработан Lambre и др. 6. Этот анализ дает количественную активность фермента путем измерения количества предпоследнем сахара гликопротеинов, галактоза, которая обнажается, когда сиаловой кислоты высвобождается NA. Так как арахисовое агглютининов (ПНК) специфически связывается с галактозой, А ПНК-пероксидаза хрена (HRPO) конъюгат может быть использован для получения колориметрического считыванием. Оптическая плотность, которая измеряется, следовательно, пропорциональна активности NA в пробе. Титры Н.И. измеряются путем определения наибольшего разведениясыворотки, которая ингибирует по меньшей мере, 50% от деятельности НС. Этот фермент-связанный лектин анализ (ELLA) осуществляют в 96-луночных планшетах, покрытых фетуина, высоко гликозилированный белок сыворотки, в качестве субстрата для NA.
Важным фактором для анализов, которые измеряют титр NI, является источником НС. Это происходит потому, что сывороток от вакцинированных или инфицированных индивидуумов содержат антитела к гемагглютинина (HA), а также антитела к NA. Антитела, которые связываются с HA может помешать деятельности НС и, следовательно, чтобы избежать неспецифического ингибирование HA-специфических антител, очищенный Атмосферный или целый вирус, содержащий антигенно-непригодность HA следует использовать в анализе. Эти вирусы могут быть получены с помощью классического реассортирования или путем обратной генетики; цель состоит в том, чтобы спасти вирус, который содержит HA подтипа, который не связан с целевым штамма и NA вируса, который изучается. Анализ, описанный в этой статье, использует вирусы гриппа А, которые генерируются оборотERSE генетика содержит HA подтипа H6 и целенаправленную NA от вирусов гриппа А, подтипа H1N1 и H3N2 5.
Результаты , полученные с помощью Эллы и миниатюрными TBA анализы показывают эти методы сопоставимы с аналогичной подтипа специфичности и чувствительности 7. ELLA не требует использования опасных химических веществ и, следовательно, является предпочтительным методом для измерения титр NI. Это легко выполнить, с помощью всего нескольких шагов (рисунок 1): образцы разводили и переносили на планшет фетуина покрытием , к которому вирус (источник NA) добавляется. Планшет инкубируют O / N и промывают перед добавлением PNA-HRPO. После 2 ч инкубации планшет промывают и пероксидазы добавляют субстрат; реакция цвета прекращается и, наконец, измеряется оптическая плотность и обратная разбавления образца, что в результате по меньшей мере, 50% ингибирование активности NA сообщается как титр на 50% конечной точки. Внутри лабораторного исследования для оценки reproducibiliти от ELLA, показал , что пластины к пластине вариабельность минимальна и оператор к оператору повторяемостью приводит к не более чем в 2 раза различий в титре 7. Последующее межлабораторная исследование изменчивости ELLA показало , что анализ имеет хорошую воспроизводимость , когда выполняется в разных лабораториях и что включение стандарта может еще больше снизить изменчивость результатов 8. Эллы подходит для измерения титра антител NI в сыворотке крови панелей из доклинических и клинических исследований вакцины против гриппа 7 , а также могут быть использованы для оценки антигенных различий между САМ вирусов гриппа 9.
Связанный с ферментом лектин анализ является практическим методом для измерения титров антител NI в сыворотке крови. Хотя ELLA был описан Ламбре и др., В 1990 году, его принятие в качестве стандартного анализа серологических был более недавно, с многочисленными лабораториях при проведении анализа для измерения титра антител NI клинических образцов 12-16. Некоторые модификации могут быть сделаны к шагам протокола без большого влияния на титр NI, которые измеряются. Например, PBS, может быть использован в качестве разбавителя, тем не менее, очень полезно сравнить кривые титрования вируса в рекомендуемых буфере (MES, рН 6,5) и PBS, до того, как решение принято, так как некоторые подтипы Н.А. значительно пониженную активность фермента в рН> 7,0. Когда оптимальное значение рН не используется, максимальный сигнал вируса может быть уменьшено, что приводит к использованию избыточного количества антигена (т.е. вирус) в анализе; в этих условиях, анализ может иметь пониженную чувствительность.
Некоторые нетингибирование н-специфических наблюдается при отсутствии лечения сывороток тестируются в ELLA. Это удаляется с помощью тепловой обработки (56 ° C в течение 45 мин), что указывает на присутствие термолабильных бета-ингибиторов. Другие неспецифические ингибиторы (α и γ-класс) гриппа HA были описаны, в частности, по отношению к H3N2 вируса гемагглютинации и инфекционности. Действительно, неспецифическое ингибирование наблюдается также в ELLA, когда H3N2 вирусы используются в качестве источника NA; Это торможение удаляют путем обработки образцов сыворотки с небольшим количеством сиалидазой 9.
Что касается других серологических анализов, отрицательный и положительный контроль должны быть включены в каждом анализе, чтобы обеспечить средства для оценки результатов анализа. Когда анализ не соответствовали критериям приемлемости, причина должна быть идентифицированы. В таблице 1 приведен список возможных шагов в анализе , которые могут быть решены для устранения неполадок.
Пров протокол ELLAided в этом отчете использует отсортированные вирусы, которые содержат происходящий HA от вируса птичьего гриппа, в качестве источника НС. Это представляет собой ограничение для проведения анализа, поскольку требуется разрешение на работу с низким уровнем патогенных вирусов птичьего гриппа. H6Nx реассортантный вирусы могут быть разделены между лабораториями после того, как они были инактивируется. Поэтому анализ может быть проведен с помощью коллабораций как только лаборатория генерации Реассортант продемонстрировал, что инактивация завершена и препарат сохранил свою активность NA. Ограничение использования H6Nx отсортированные вирусы могут быть преодолены с помощью неинфекционные источники НС. Например, некоторые лаборатории использовали очищенный рекомбинантный NA 17, в то время как другие использовали вирусоподобные частицы (VLP) 15. Тем не менее, ни один рекомбинантный NA, ни VLPs легко доступны, и поэтому мы продолжаем использовать вирусы гриппа с антигенно-несогласованной птичьего HA.
Традиционныйметод измерения титра антител NI не является практичным по нескольким причинам; наибольшую озабоченность вызывают вредные химические вещества, которые необходимы для получения цветной реакции. Кроме того, большие объемы пробы нужны, и анализ является сложной операцией. В противоположность этому, ELLA легко выполнить и в формате, который позволяет титрование разумного количества образцов. Данные исследований , которые изучали ELLA изменчивости , показывают , что доходность анализа воспроизводимые результаты 7,8. ELLA имеет, следовательно, сделал регулярные измерения титров антител NI возможных, и предполагается, что он будет использоваться чаще в лабораториях, проводящих исследования серологические.
Есть несколько важных шагов, которые необходимо учитывать при выполнении Эллой. Во-первых, неспецифические ингибиторы активности NA должны быть удалены. Эти ингибиторы, как правило, термолабильных и разрушаются при тепловой обработке при температуре 56 ° С в течение 45 мин. Термическая обработка достаточно для удаления не специфичнуюFIC ингибиторы из образцов при H6 реассортант вирусы используются в качестве источника NA, тем не менее, когда вирусы H3N2 используются в ELLA, сывороточные факторы, которые связываются с гемагглютинина также мешать Эллы и должны быть удалены путем обработки небольшим количеством сиалидазой до термической обработки 9. Во- вторых, избыточное количество антигена, т.е. реассортантного вируса H6Nx, не следует использовать , так как это снижает чувствительность анализа. Тщательное титрование вируса поэтому является важным шагом; количество антигена , используемого в каждом анализе должен обеспечивать сигнал , который значительно выше фона, и должна быть в пределах линейного диапазона кривой титрования, т.е. сигнал (оптическая плотность) должна быть пропорциональна вируса разбавления.
В дополнение к обычному серологических, Эллы может быть использован для оценки антигенных различий между НАН вирусов сезонного гриппа. Эта информация может быть очень полезным при выборе штаммов вируса для включения аs вакцин-кандидатов и будет способствовать более глубокому пониманию иммунных давлений, которые приводят к антигенного дрейфа НС. Кроме того, антигенный анализ НСБУ от свиного или птичьего гриппа может предоставить важную информацию для определения пандемического потенциала развивающихся штаммов.
The authors have nothing to disclose.
This project was funded by intramural PanFlu funds from the Center for Biologics Evaluation and Research (CBER). Plasmids used to prepare reassortant viruses were kindly provided by Robert Webster, St Jude Children’s Research Hosptial, Memphis, TN. We are indebted to Ewan Plant and Haruhiko Murata for critical review of the manuscript.
coating buffer | KPL | 50-84-01 |
fetuin | Sigma | F3385 |
5X MES, pH 6.5 | KD-Medical | PBS-0134 |
CaCl2 | Sigma | C7902 |
30% BSA | Sigma | A8327 |
Tween 20 | Sigma | P1379 |
Lectin PNA-HRPO | Sigma | L7759 |
PBS-T | Sigma | P3563-10PAK |
o-Phenylenediamine dihydrochloride | Sigma | P8287 |
phosphate-citrate buffer | Sigma | P4922 |
Sulfuric acid | Sigma | 258105 |
96-well Maxisorp plates | NUNC | 439454 |
96-well round bottom well plates | NUNC | 267245 |
Plate sealers | Thermo Scientific | 14-245-192B |
chicken eggs | Charles River Laboratories | 9 day old embryonated specific pathogen free (SPF) chicken eggs |
multichannel pipette | Variety of suppliers e.g., Rainin, Eppendorf | 8 or 12 channel manual pipettem 50-250 µl volume |
Pipette tips | Depends on pipettor brand | Depends on pipettor brand |
Plate reader, with 490 nm filter | Perkin Elmer | Victor V |
water bath set to 37 °C | Variety of suppliers | Variety of models |
water bath set to 56 °C | Variety of suppliers | Variety of models |
refrigerator set to 4 °C | Variety of suppliers | Variety of models |
incubator set to 37 °C | Variety of suppliers | Variety of models |