We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.
Les anticorps dirigés contre la neuraminidase (NA), la seconde protéine de surface la plus abondante sur le virus de la grippe, contribuer à la protection contre la grippe. Les méthodes traditionnelles de mesure de NA inhibant (NI) des titres d'anticorps ne sont pas pratiques pour la sérologie de routine. Ce protocole décrit la lectine de dosage lié à une enzyme (ELLA), une méthode pratique pour mesurer les titres NI qui est effectué dans des plaques à 96 puits revêtues d'un substrat de grande glycoprotéine, la fétuine. clive NA acides terminaux sialique de fétuine, exposant le sucre avant-dernier, galactose. Agglutinine d'arachide (PNA) est une lectine ayant une spécificité pour le galactose, et donc l'étendue de désialylation peut être quantifié en utilisant un conjugué de peroxydase de raifort PNA, suivi par l'addition d'un substrat chromogène de la peroxydase. La densité optique mesurée est proportionnelle à l'activité de NA. Pour mesurer NI des titres d'anticorps, des dilutions en série de sérums sont incubées à 37 ° CO / N sur des plaques de fétuine-enduit avec un montant fixe of NA. L'inverse de la dilution sérique la plus élevée qui se traduit par ≥50% d'inhibition de l'activité NA est désigné comme un titre d'anticorps NI. Le ELLA fournit un format pratique pour l'évaluation de routine des réponses d'anticorps humains suite à une infection de la grippe ou la vaccination.
Neuraminidase (NA) est une glycoprotéine exprimée sur la surface de virions de la grippe. Son activité enzymatique est essentielle pour la libération de particules virales nouvellement formées des cellules infectées 1,2. Des anticorps qui inhibent l' activité NA réduire les titres viraux et des symptômes de la maladie dans des modèles animaux et 3 sont en corrélation avec la résistance contre une maladie chez l'être humain 4. Une augmentation de l'inhibition NA (NI) des titres après la vaccination peut donc servir d'indicateur de l'efficacité du vaccin, mais de nombreuses études d'immunogénicité de la grippe passé ne comprennent pas ce point final, car le dosage traditionnel pour mesurer NI taux d'anticorps est impraticable pour la sérologie de routine.
La méthode traditionnelle pour mesurer les titres NI est basée sur la quantification de la quantité d'acide sialique qui est clivé à partir de glycoconjugués par NA 1. Cette méthode, souvent appelée la méthode acide thiobarbiturique (TBA), utilise des produits chimiques dangereux pour convertir ac sialiqueIdentifiant à un chromophore qui peut être quantifiée par spectrométrie. L'essai ne convient pas pour tester un grand nombre d'échantillons, car des tubes en verre individuels sont utilisés, ce qui rend le dosage encombrant. Miniaturisation de l'essai à un plaques à 96 puits fournit un format plus pratique 5, cependant cet essai nécessite encore l'utilisation de produits chimiques toxiques et par conséquent ne sont pas idéales.
Un test alternatif pour mesurer NI taux d'anticorps a été développé par Lambré et al. 6. Ce dosage quantifie l'activité enzymatique en mesurant la quantité de sucre avant-dernier glycoprotéines, le galactose, qui est exposée lorsque l'acide sialique est libéré par NA. Etant donné que l'arachide agglutinine (PNA) se lie spécifiquement au galactose, une peroxydase de raifort PNA-(HRPO) peut être utilisé pour obtenir une lecture colorimétrique. La densité optique mesurée est donc proportionnelle à l'activité NA dans l'échantillon. Les titres NI sont mesurés en déterminant la plus haute dilutionde sérum qui inhibe au moins 50% de l'activité de NA. Cette lectine dosage lié à une enzyme (ELLA) est réalisée dans des plaques à 96 puits revêtues de fétuine, une protéine de sérum fortement glycosylée, comme substrat pour NA.
Une considération importante pour des dosages qui mesurent les titres NI, est la source de NA. En effet, des sérums d'individus infectés ou vaccinés contiennent des anticorps anti-hémagglutinine (HA), ainsi que des anticorps à NA. Des anticorps qui se lient à HA peuvent interférer avec l'activité de NA et, par conséquent, pour éviter une inhibition non spécifique par des anticorps spécifiques de HA, NA purifié ou d'un virus contenant un ensemble HA antigéniquement mésapparié doit être utilisé dans l'essai. Ces virus peuvent être générés par réassortiment classique ou par génétique inverse; l'objectif est de récupérer un virus qui contient un sous-type HA qui ne soit pas lié à la souche cible, et NA du virus qui est en cours d'étude. Le test décrit dans cet article utilise des virus grippaux A qui sont générés par revErse génétique pour contenir HA du sous – type H6 et la NA ciblée contre les virus de la grippe A, sous – types H1N1 et H3N2 5.
Les résultats générés par ELLA et des essais de TBA miniaturisés montrent ces méthodes sont comparables, avec une spécificité de sous – type similaire et de sensibilité 7. ELLA ne nécessite pas l'utilisation de produits chimiques dangereux et est donc la méthode préférée pour mesurer les titres NI. Il est facile à réaliser, avec seulement quelques étapes (figure 1): Les échantillons sont dilués et transférés dans une plaque de fétuine revêtu auquel le virus (la source de NA) est ajouté. La plaque est incubée O / N et lavé avant d'ajouter PNA-HRPO. Après une incubation de 2 heures, la plaque est lavée et le substrat de la peroxydase est ajoutée; la réaction colorée est arrêtée et, enfin, la densité optique est mesurée et l'inverse de la dilution de l'échantillon qui a donné lieu à au moins 50% d'inhibition de l'activité NA est rapportée comme le titre à point final de 50%. Une étude intra-laboratoire pour évaluer reproducibility de l'ELLA, a montré que la variabilité plaque à la plaque est minime et la répétabilité opérateur à opérateur a donné lieu à aucune différence de plus de 2 fois à titre 7. Une étude inter-laboratoire ultérieur de ELLA variabilité a montré que le test a une bonne reproductibilité lorsqu'il est effectué dans des laboratoires différents et que l' inclusion d'une norme peut réduire davantage la variabilité des résultats 8. Le ELLA est adapté à la mesure des titres d'anticorps NI dans les panneaux de sérum provenant d' études précliniques et cliniques vaccins contre la grippe et 7 peut également être utilisé pour évaluer les différences antigéniques entre les agences nationales de virus grippaux 9.
Le dosage de la lectine-enzymatique est une méthode pratique pour mesurer NI des titres d'anticorps dans le sérum. Bien que ELLA a été décrit par Lambre et al., En 1990, son acceptation comme un test sérologique standard est plus récente, avec de nombreux laboratoires qui effectuent le test pour mesurer les titres d'anticorps NI d'échantillons cliniques 12-16. Certaines modifications peuvent être apportées aux étapes du protocole sans un impact important sur les titres NI qui sont mesurés. Par exemple, le PBS peut être utilisé comme diluant, cependant, il est très utile de comparer les courbes de titrage du virus dans le tampon recommandé (MES, pH 6,5) et du PBS avant qu'une décision soit prise, puisque certains sous-types de NA ont réduit de manière significative l'activité enzymatique à pH> 7,0. Lorsque le pH optimal est pas utilisé, le signal maximum du virus peut être réduit, ce qui entraîne l'utilisation d'une quantité excessive de l' antigène ( par exemple, virus) dans le dosage; dans ces conditions, l'essai peut avoir une sensibilité réduite.
Certains nel'inhibition spécifique de n est observée lorsque les sérums non traités sont testés dans le ELLA. Ceci est enlevé par traitement thermique (56 ° C pendant 45 min), ce qui indique la présence d'inhibiteurs de ß-thermolabiles. D'autres inhibiteurs non-spécifiques (α et γ-classe) de la grippe HA ont été décrits, notamment en relation avec le virus H3N2 hémagglutination et l'infectiosité. En effet, une inhibition non spécifique est également observée dans ELLA lorsque H3N2 sont utilisés comme source de NA; cette inhibition est éliminé par traitement des échantillons de sérum avec une petite quantité de 9 sialidase.
Comme pour d'autres tests sérologiques, des témoins négatifs et positifs doivent être inclus dans chaque essai pour fournir un moyen pour évaluer la performance de l'essai. Lorsque le test n'a pas respecté les critères d'acceptation, la raison doit être identifiée. Le tableau 1 donne une liste des étapes potentielles dans le dosage qui peuvent être traitées pour résoudre les problèmes.
Le prov protocole ELLAided dans le présent rapport utilise des virus réassortis qui contiennent le HA provenant d'un virus aviaire, comme source de NA. Ceci présente une limitation à la réalisation du test parce qu'un permis est nécessaire de travailler avec les virus aviaires faiblement pathogènes. virus réassortis H6Nx peuvent être partagés entre les laboratoires après qu'ils ont été inactivés. Par conséquent, le dosage peut être effectué grâce à des collaborations une fois le laboratoire de la génération du virus réassorti a démontré que l'inactivation est complète et la préparation a conservé son activité de NA. La contrainte d'utiliser H6Nx virus réassortis peuvent être surmontés en utilisant des sources non infectieuses de NA. Par exemple, certains laboratoires ont utilisé recombinant purifié NA 17, tandis que d' autres ont utilisé des particules virales (VLP) 15. Cependant, ni recombinant NA ni VLP sont facilement disponibles et donc nous continuons à utiliser des virus de la grippe aviaire avec un HA antigéniquement dépareillés.
Le traditionnelméthode pour mesurer les titres d'anticorps NI est pas pratique pour plusieurs raisons; les plus préoccupants sont les produits chimiques nocifs qui sont nécessaires pour produire une réaction colorée. En outre, de grands volumes d'échantillon sont nécessaires et le dosage est lourde à effectuer. En revanche, le ELLA est facile à réaliser et est dans un format qui permet de titrage d'un nombre suffisant d'échantillons. Les données des études qui ont examiné la variabilité ELLA montrent que les résultats , les rendements d'essai reproductibles 7,8. Le ELLA a donc rendu la mesure de routine des titres possibles d'anticorps NI, et il est prévu qu'il sera utilisé plus fréquemment par les laboratoires effectuant des études sérologiques.
Il y a plusieurs étapes critiques qui doivent être pris en considération lors de l'exécution du ELLA. Tout d'abord, des inhibiteurs non spécifiques de l'activité NA doivent être enlevés. Ces inhibiteurs sont généralement thermolabile et sont détruites par un traitement thermique à 56 ° C pendant 45 min. Le traitement thermique est suffisante pour éliminer non spécifiquefic inhibiteurs à partir d'échantillons où les virus réassortis H6 sont utilisés comme source de NA, cependant, lorsque H3N2 sont utilisés dans le ELLA, des facteurs sériques qui se lient à l'hémagglutinine interfèrent également avec l'ELLA et doivent être éliminés par traitement avec une petite quantité de sialidase avant le traitement thermique 9. D' autre part, une quantité excessive d'antigène, à savoir, un virus réassorti H6Nx, ne devrait pas être utilisé , car cela réduit la sensibilité du dosage. titration soigneuse du virus est donc une étape essentielle; la quantité d'antigène utilisée dans chaque essai doit fournir un signal qui est bien au- dessus du fond, et il doit se situer dans la plage linéaire de la courbe de titrage, soit le signal (densité optique) doit être proportionnelle à la dilution de virus.
En plus de la sérologie de routine, l'ELLA peut être utilisé pour évaluer les différences antigéniques entre NAs de virus de la grippe saisonnière. Cette information peut être très utile lors de la sélection des souches de virus pour l'inclusion d'unes candidats vaccins et facilitera une meilleure compréhension des pressions immunitaires qui se traduisent par une dérive antigénique de NA. En outre, l'analyse antigénique des NAs de virus de la grippe porcine ou aviaire peut fournir des informations cruciales pour déterminer le potentiel pandémique de souches émergentes.
The authors have nothing to disclose.
This project was funded by intramural PanFlu funds from the Center for Biologics Evaluation and Research (CBER). Plasmids used to prepare reassortant viruses were kindly provided by Robert Webster, St Jude Children’s Research Hosptial, Memphis, TN. We are indebted to Ewan Plant and Haruhiko Murata for critical review of the manuscript.
coating buffer | KPL | 50-84-01 |
fetuin | Sigma | F3385 |
5X MES, pH 6.5 | KD-Medical | PBS-0134 |
CaCl2 | Sigma | C7902 |
30% BSA | Sigma | A8327 |
Tween 20 | Sigma | P1379 |
Lectin PNA-HRPO | Sigma | L7759 |
PBS-T | Sigma | P3563-10PAK |
o-Phenylenediamine dihydrochloride | Sigma | P8287 |
phosphate-citrate buffer | Sigma | P4922 |
Sulfuric acid | Sigma | 258105 |
96-well Maxisorp plates | NUNC | 439454 |
96-well round bottom well plates | NUNC | 267245 |
Plate sealers | Thermo Scientific | 14-245-192B |
chicken eggs | Charles River Laboratories | 9 day old embryonated specific pathogen free (SPF) chicken eggs |
multichannel pipette | Variety of suppliers e.g., Rainin, Eppendorf | 8 or 12 channel manual pipettem 50-250 µl volume |
Pipette tips | Depends on pipettor brand | Depends on pipettor brand |
Plate reader, with 490 nm filter | Perkin Elmer | Victor V |
water bath set to 37 °C | Variety of suppliers | Variety of models |
water bath set to 56 °C | Variety of suppliers | Variety of models |
refrigerator set to 4 °C | Variety of suppliers | Variety of models |
incubator set to 37 °C | Variety of suppliers | Variety of models |