Summary

פיתוח בינוני אגר chromogenic רגיש וספציפי יותר לצורך זיהוי של<em> Parahaemolyticus Vibrio</em> ו אחר<em> Vibrio</em> מינים

Published: November 08, 2016
doi:

Summary

Detection and isolation of clinically relevant Vibrio species require selective and differential culture media. This study evaluated the ability of a new chromogenic medium to detect and identify V. parahaemolyticus and other related species. The new medium was found to have better sensitivity and specificity than the conventional medium.

Abstract

זיהומי foodborne בארה"ב נגרמת על ידי מיני Vibrio הראו מגמת עלייה. בשנת מהמין Vibrio, parahaemolyticus V. אחראי רוב דלקות -associated Vibrio. לפיכך, בידול מדויק בין spp Vibrio. וזיהוי של V. parahaemolyticus יש חשיבות קריטית כדי להבטיח את שלומם של אספקת המזון שלנו. למרות בטכניקות מולקולריות נפוצות יותר ויותר, שיטות-תלוי תרבות עדיין נעשות באופן שיגרתי והם נחשבים שיטות סטנדרטיות בנסיבות מסוימות. לפיכך, מדיום אגר chromogenic רומן נבדק במטרה לספק שיטה טובה יותר עבור בידוד ובידול של spp Vibrio משמעות קלינית. הפרוטוקול משווה את הרגישות, סגולי וזיהוי הגבול לצורך זיהוי של V. parahaemolyticus בין מדיום chromogenic החדש מדיום קונבנציונלי. V. השונה זני parahaemolyticus (n = 22) מחדשהצגת קפסיד ומקור מגוונים של מקורות ששמשו. הם זוהו בעבר על ידי מינהל המזון והתרופות האמריקאי (FDA) המרכז לבקרת מחלות ומניעתן (CDC), ומאומת נוספת במעבדה שלנו על ידי tlh -PCR. לפחות ארבעה ניסויים נפרדים, זנים אלה היו מחוסנים על מלחי סוכרוז chromogenic אגר thiosulfate-ציטראט-מרה (TCBS) אגר, המהווה את המדיום המומלץ culturing מין זה, ואחריו דגירה על 35-37 מעלות צלזיוס למשך 24 hr -96. שלושה V. זני parahaemolyticus (13.6%) לא גדלו באופן אופטימלי על TCBS, בכל זאת הציגו מושבות ירוקות אם יש צמיחה. שני זנים (9.1%) לא הניב המושבות ציאן הצפויות על אגר chromogenic. V. אי זני parahaemolyticus (n = 32) נבדקו גם כדי לקבוע את הספציפיות של אגר chromogenic. בין זנים אלה, 31 לא גדלו ולא הפגינו שום מורפולוגיה מושבה אחרות. ההתאוששות הממוצעת של V. parahaemolyticus על chromogenic אגר היה ~ 96.4% ביחס ל אגר סויה tryptic בתוספת 2% NaCl. לסיכום, אגר chromogenic החדש הוא מדיום יעיל לגילוי V. parahaemolyticus וכדי להבחין בינו vibrios האחר.

Introduction

כחבר של סוג Vibrio, V. parahaemolyticus הוא גראם שלילי, שאינם יוצרי נבגים, מעוקל, חיידק דמוי מוט. הוא מציג תנועתיות גבוהה בשתי סביבות נוזלות חצי מוצק. רוב V. זני parahaemolyticus הם פתוגניים לבני אדם, אך תת פתוגניים גרמו מגיפות מגפות, ומכאן מין זה נחשב פתוגן foodborne חשוב במדינות רבות 1,2. השכיחות של זיהום Vibrio בארה"ב הוכיחה מגמת עלייה מאז 2000 3. בין spp Vibrio., V. parahaemolyticus הוא המין הנפוץ ביותר בגרימת מחלות בארצות הברית 4,5. מינים אחרים רלוונטיים קליני כוללים V. alginolyticus, V. vulnificus, V. cholerae ועוד אחוז קטן של המחלות נגרם על ידי מינים רבים בו זמנית.

Parahaemolyticus V. הוא i טבעיnhabitant מים ימיים ולכן התפוצה הרחבה ביותר במי אוקיינוס ​​ברחבי העולם כולל שפכי נהרות. המין התגלה בשנת 1950 לאחר התפרצות של הרעלת מזון ביפן. בארה"ב, המין בודד לראשונה במי ים, משקעים, סרטנים וצדפות באזור Puget Sound 6,7. ניזונים מסנן בבתי גידול ימי, כגון צדפות צדפה, עשויים להכיל סוגי V. parahaemolyticus כחלק פלורה 8 הטבעית שלהם. ככזה, V. זיהומים parahaemolyticus ב האנושי לעיתים קרובות קשור לצריכה של פירות ים מזוהמים, במיוחד צדפות נא או שלא בושל. מסלול משותף פחות כניסה מתרחש כאשר פצע פתוח חשוף מי ים, מוביל לזיהום עור. רוב V. זני parahaemolyticus אינם גורם למחל אדם, אך תת מסוימים מחסה גורמים ארסיים כמו המוליזין ישיר thermostable (TDH) הם פתוגניים. התסמינים הנפוצים ביותר של V. foodborne parahaemolyticus זיהום הנושלשולים וכאבי בטן, ואחריו בחילות, הקאות וחום. כאבי ראש וצמרמורות גם מדווחות. תקופת הדגירה החציוני הוא 15 שעות, אבל יכול להיות עד 96 שעות לאחר צריכת כמות מספקת של זנים פתוגניים 9. המחלה נמשכת בין יומיים לשלושה ימים. הסימפטומים גסטרואנטריטיס הנגרמת על ידי V. parahaemolyticus הם בעיקר מעצמם ולכן טיפול מיוחד אין צורך. מקרים קלים של גסטרואנטריטיס ניתן לטפל ביעילות על ידי למקרה של התייבשות. עוד מחלות קשות ניתן לטפל על ידי אנטיביוטיקה כגון טטרציקלין או ציפרופלוקסצין 10. שיעור תמותה הוא כ -2% למקרי גסטרו, אך הוא עשוי להיות גבוה ככל 29% למי לפתח זיהום או הרעלת דם דם. כל אדם אשר צורכת פירות ים או יש פצע פתוח חשופים מי ים נמצא בסיכון של V. זיהום parahaemolyticus. הצורה חמורה יותר של מחלות, הרעלת דם מסכני חיים, נפוצה יותר בתוך תת-אוכלוסייה עם שיתוף רפואי בסיסיnditions 11, הכולל אלכוהוליזם, מחלות כבדות, סוכרת, מחלת כליות, ממאירות, ומצבים אחרים מובילים לתגובה חיסונית מוחלשת. יש לציין, קבוצה זו של אנשים היא גם בסיכון גבוה יותר לחלות במחלות קשות שנגרם על ידי V. vulnificus, אשר ניתן למצוא בבתי גידול טבעי דומה V. parahaemolyticus.

V. parahaemolyticus מבודדת באופן שגרתי באמצעות thiosulfate-ציטראט מרה מלחי סוכרוז (TCBS) אגר כמדיום סלקטיבית ההפרש. עשרה במי peptone אלקליין עלולים להקדים בידוד על אגר TCBS. מושבות משוערות על TCBS אז נבדקים נוספים מערך של בדיקות ביוכימיות / או מבחנים מולקולריים מיקוד הנוכחות של גנים ספציפי מינים. בשיטות מבוססות PCR משמשים לעתים קרובות כדי לאשר את זהותם של V. parahaemolyticus ידי הגברת גן המוליזין thermolabile, tlh 12.

לא משנה של chOICE של שיטות אישור, חשוב שיהיה מדיום יעיל לבודד ולהבחין V. parahaemolyticus מ vibrios הימי אחר מלכתחילה. TCBS נעשה שימוש בדרך כלל להבדיל מינים בתוך הסוג Vibrio לפי היכולות שלהם כדי להתסיס סוכרוז 12. תגובת תסיסה חיובית מלווה בשינוי בצבע הכחול Bromothymol אינדיקטור pH. V. מושבות parahaemolyticus הן די מובחנות TCBS, מפגין כחול לצבע ירוק. עם זאת, המדיום הזה לא יכול בקלות להבחין V. alginolyticus ו V. cholerae. תסיסת סוכרוז מינים פרוטאוס עשויים לייצר מושבות צהובות דומות V. cholerae או V. alginolyticus 13. על בידוד ראשוני על TCBS, V. parahaemolyticus יכול להיות גם בטעות כמפר Aeromonas hydrophila, shigelloides Plesiomonas, ו Pseudomonas spp 14. זנים עם Ferm סוכרוז מתעכבentation עלול להתבלבל עם סוכרוז אחר nonfermenting 13 Vibrio, הכולל V. parahaemolyticus. TCBS נמצאה להיות רגישים לא נגד Escherichia coli, putrefaciens Pseudomonas, בין היתר. מינים אחרים כמה להניב ירוק מושבות אפורות אשר מבולבלות פוטנציאלי עם V. parahaemolyticus או V. vulnificus 15. כתוצאה מכך, רצוי לפתח תקשורת תרבות האלטרנטיבית ברגישות טובה יותר וספציפי כלפי גילוי ובידוד V. parahaemolyticus ומינים אחרים קשורים זה לזה.

חלופות מדיה פותחו מספר לאחרונה. בנוסף להכללת סוכנים סלקטיבית, רוב לשלב מצעים chromogenic להבדיל מבוסס מינים על פעילות אנזימטית ההפרש שלהם. לדוגמה, indoxyl-β-glucoside ו indoxyl-β-galactoside שימשו מצעים chromogenic להבדיל V. פסקתימושבות haemolyticus (אשר מופיעים בצבע ירוק כחלחל) מאלו של V. cholerae (סגול) בשל היכולות ההפרש שלהם לייצר-glucosidase β ו β-galactosidase 16. ניסוחים שונים של אגר chromogenic שפותחו על ידי מספר קבוצות הוערכו ו דווחו לבצע דומה ל- או יותר טוב 17,18,19 TCBS. יתרון של שימוש בינוני chromogenic הוא כי והצביעה סביב המדיום היא מינימאלית ובכך מקלות על הבידוד של מושבות בפרט. במחקר זה, החוקרים העריכו את היכולת של מדיום chromogenic שעוצבה זה מקרוב כדי לזהות ולבודד V. cholerae, V. parahaemolyticus, ו V. vulnificus; עם דגש מיוחד על יכולתה להבחין V. parahaemolyticus ממינים אחרים.

Protocol

1. מדיה Culturing של זנים מיקרוביאלית הערה: טכניקות ספטית השתמש בכל הניסויים. להשתמש בחומרים סטריליים. לעקר את כל המכולות, הכלים מגיבים לפני השימוש. חיטוי כל החומרים פסולת לפני הסילוק משום שהם נחשבים ביולוגיים מסוכנים. טמפרטורת חיטוי ש?…

Representative Results

במחקר זה, 54 זנים של חיידקים נאספו, שכלל 22 זנים בתוך V. מיני parahaemolyticus, 19 מיני Vibrio אחרים, ו -13 מיני Vibrio מייננת (טבלה 1). רוב V. זני parahaemolyticus התקבלו גם מן ה- FDA, ה- CDC או מחלקות בריאות ממלכתיות אחרות. הם מייצגים קפסיד מגוונים…

Discussion

מחקר זה מתמקד בפיתוח התקשורת והתרבות והערכה. כמקובל, TCBS היא סלקטיבית ובינוניים ההפרש המשמש לבידוד ואיתור V. parahaemolyticus, V. cholerae ו V. vulnificus 12. עם זאת, מגבלות דווחו על המדיום הזה, כגון אי היכולת להבדיל V. cholerae ממיני Vibrio אחרים. סוכרוז אינדיקטור pH הם סוכ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים מ Channey, א צ'או, ו ק תומס על עזרתם על הפרויקט. אספקה ​​הפרויקט מומנו חלקית על ידי אוניברסיטת מדינת הפוליטכני בקליפורניה.

Materials

Reagent/Equipment
Agar Fisher Scientific DF0140-15-4 may use other brands
Autoclave Any
BHI powder Fisher Scientific DF0418-17-7 may use other brands
Blender Any to blend oyster meat
CampyGen gas generator Hardy Diagnostics CN035A to provide a microaerophilic atmosphere; may use other brands
Chocolate agar plates Hardy Diagnostics E14 may use other brands
Common PCR reagents (dNTPs, MgCl2, Taq Polymerase) Any or use PCR beads (Fisher Sci 46-001-014)
Culture tubes Fisher Scientific S50712 may use other brands
Eppendorf tubes Fisher Scientific S348903 may use other brands
Gel doc Any
HardyChrom Vibrio agar plates Hardy Diagnostics G319 This study evaluates this medium
Incubator Any
Inoculating loops Fisher Scientific 22-363-606 10 microliter-size was used in this study
NaCl Fisher Scientific BP358-212 may use other brands
Oysters Any
PBS Fisher Scientific R23701 may use other brands
Petri dish Fisher Scientific FB0875713 may use other brands
Pipette and tips Any Sterilized tips
Primers for tlh IDT DNA
Scale Any
Spreader Fisher Scientific 08-100-11 Beads may be used instead
Stomacher blender Stomacher 400 Samples were homogenized at 200 rpm for 30 sec.  Other homogenizer can be used.
Sterile filter bags for blenders Fisher Scientific 01-812-5
TCBS powder Hardy Diagnostics 265020 This study evaluates this medium
Thermocycler Any
TSB powder Fisher Scientific DF0370-07-5 may use other brands
UV viewing cabinet Any Emit long-wave UV light
Water bath Any
Name Sources Catalog Number Comments
Bacterial species and strains
Aeromonas hydrophila ATCC
Candida albicans ATCC
Campylobacter jejuni ATCC
Escherichia coli ATCC
Proteus mirabilis ATCC
Pseudomonas aeruginosa ATCC
Staphylococcus aureus ATCC
Salmonella Choleraesuis ATCC
Shigella boydii ATCC
Shigella flexneri ATCC
Shigella sonnei ATCC
Vibrio alginolyticus ATCC
V. cholerae (serotypes include O139, O1, non O1, El Tor biovars) FDA, ATCC
V. damsela FDA
V. fisherii Environment
V. fluvialis CDC
V. furnissii CDC
V. hollisae FDA
V. metschnikovii ATCC
V. mimicus FDA
V. parahaemolyticus(serotypes include O3:K6, O1:K56, O4:K8, O5:K15, O8, etc) ATCC, FDA, CDC, Environment
V. proteolyticus FDA
V. vulnificus FDA

References

  1. Yeung, P. S., Boor, K. J. Epidemiology, pathogenesis, and prevention of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections. Foodborne Pathog. Dis. 1 (2), 74-88 (2004).
  2. Yeung, P. S. M., Boor, K. J., Faruque, S. M. Epidemiology, molecular biology, and detection of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections. Foodborne and Waterborne Bacterial pathogens: Epidemiology, Evolution and Molecular Biology. , 153-184 (2012).
  3. Centers for Disease Control and Prevention. Vital Signs: Incidence and Trends of Infection with Pathogens Transmitted Commonly Through Food – Foodborne Diseases Active Surveillance Network, 10 U.S. Sites, 1996-2010. Morbidity and Mortality Weekly Report. 10, 1996-2010 (2011).
  4. . Summary of human Vibrio cases reported to CDC, 2008 Available from: https://stacks.cdc.gov/view/cdc/21591 (2008)
  5. Scallan, E., et al. Foodborne illness acquired in the United States – major pathogens. Emerg. Infect. Dis. 17 (1), 7-15 (2011).
  6. Baross, J., Liston, J. Occurrence of Vibrio parahaemolyticus and related hemolytic vibrios in marine environments of Washington State. Appl. Microbiol. 20 (2), 179-186 (1970).
  7. Baross, J., Liston, J. Isolation of Vibrio parahaemolyticus from the Northwest Pacific. Nature. 217 (5135), 1263-1264 (1968).
  8. Kueh, C. S., Chan, K. Y. Bacteria in bivalve shellfish with special reference to the oyster. J. Appl. Bacteriol. 59 (1), 41-47 (1985).
  9. Food and Drug Administration. . Bad Bug Book, Foodborne Pathogenic Microorganisms and Natural Toxins. , (2012).
  10. Qadri, F., et al. Adaptive and inflammatory immune responses in patients infected with strains of Vibrio parahaemolyticus. J. Infect. Dis. 187 (7), 1085-1096 (2003).
  11. MacFaddin, J. F. . Media for isolation-cultivation-identification-maintenance of medical bacteria. 1, (1985).
  12. Bottone, E. J., Robin, T. Vibrio parahaemolyticus: suspicion of presence based on aberrant biochemical and morphological features. J. Clin. Microbiol. 8 (6), 760-763 (1978).
  13. Lotz, M. J., Tamplin, M. L., Rodrick, G. E. Thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose agar and its selectivity for clinical and marine vibrio organisms. Ann. Clin. Lab. Sci. 13 (1), 45-48 (1983).
  14. Hara-Kudo, Y., Nishina, T., Nakagawa, H., Konuma, H., Hasegawa, J., Kumagai, S. Improved method for detection of Vibrio parahaemolyticus in seafood. Appl. Environ. Microbiol. 67 (12), 5819-5823 (2001).
  15. Eddabra, R., Piemont, Y., Scheftel, J. M. Evaluation of a new chromogenic medium, chromID Vibrio, for the isolation and presumptive identification of Vibrio choleare and Vibrio parahaemolyticus from human clinical specimens. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 30 (6), 733-737 (2011).
  16. Kodaka, H., Teramura, H., Mizuochi, S., Saito, M., Matsuoka, H. Evaluation of the Compact Dry VP method for screening raw seafood for total Vibrio parahaemolyticus. J. Food. Prot. 72 (1), 169-173 (2009).
  17. Su, Y. C., Duan, J., Wu, W. H. Selectivity and specificity of a chromogenic medium for detecting Vibrio parahaemolyticus. J. Food Prot. 68 (7), 1454-1456 (2005).
  18. Bej, A. K., Patterson, D. P., Brasher, C. W., Vickery, M. C., Jones, D. D., Kaysner, C. A. Detection of total and hemolysin-producing Vibrio parahaemolyticus in shellfish using multiplex PCR amplification of tl, tdh and trh. J. Microbiol. Methods. 36 (3), 215-225 (1999).
  19. Yeung, P. S. M., DePaola, A., Kaysner, C. A., Boor, K. J. A PCR assay for specific detection of the pandemic Vibrio parahaemolyticus O3:K6 clone from shellfish. J. Food Sci. 68 (4), 1459-1466 (2003).
  20. Yeung, P. S. M., Hayes, M. C., DePaola, A., Kaysner, C. A., Kornstein, L., Boor, K. J. Comparative phenotypic, molecular, and virulence characterization of Vibrio parahaemolyticus O3:K6 isolates. Appl. Environ. Microbiol. 68 (6), 2901-2909 (2002).
  21. Duan, J., Su, Y. -. C. Comparison of a chromogenic medium with thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose agar for detecting Vibrio parahaemolyticus. J. Food Sci. 70, M125-M128 (2005).
  22. Pinto, A. D., Terio, V., Novello, L., Tantillo, G. Comparison between thiosulphate-citrate-bile salt sucrose (TCBS) agar and CHROMagar Vibrio for isolating Vibrio parahaemolyticus. Food Control. 22 (1), 124-127 (2011).
  23. Canizalez-Roman, A., Flores-Villaseñor, H., Zazueta-Beltran, J., Muro-Amador, S., Leòn-Sicairos, N. Comparative evaluation of a chromogenic agar medium-PCR protocol with a conventional method for isolation of Vibrio parahaemolyticus strains from environmental and clinical samples. Can J Microbiol. 57 (2), 136-142 (2011).
  24. Kriem, M. R., et al. Prevalence of Vibrio spp. in raw shrimps (Parapenaeus longirostris) and performance of a chromogenic medium for the isolation of Vibrio strains. Lett Appl Microbiol. 61 (3), 224-230 (2015).
  25. Food Drug Administration. Statistical guidance on reporting results from studies evaluating diagnostic tests. http://www.fda.gov/RegulatoryInformation/Guidances/ucm071148.htm. , (2007).
  26. Burd, E. M. Validation of laboratory-developed molecular assays for infectious diseases. Clin Microbiol Rev. 23 (3), 550-576 (2010).

Play Video

Cite This Article
Yeung, M., Thorsen, T. Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species. J. Vis. Exp. (117), e54493, doi:10.3791/54493 (2016).

View Video