Summary

Ontwikkeling van een meer gevoelige en specifieke Chromogenic Agar Medium voor de detectie van<em> Vibrio parahaemolyticus</em> En andere<em> Vibrio</em> Species

Published: November 08, 2016
doi:

Summary

Detection and isolation of clinically relevant Vibrio species require selective and differential culture media. This study evaluated the ability of a new chromogenic medium to detect and identify V. parahaemolyticus and other related species. The new medium was found to have better sensitivity and specificity than the conventional medium.

Abstract

Voedselinfecties in de Verenigde Staten, veroorzaakt door Vibrio soorten hebben laten zien een stijgende trend. In het genus Vibrio, V. parahaemolyticus is verantwoordelijk voor het merendeel van Vibrio geassocieerde infecties. Aldus nauwkeurige differentiatie bij Vibrio spp. en detectie van V. parahaemolyticus is van cruciaal belang voor de veiligheid van onze voedselvoorziening te waarborgen. Hoewel moleculaire technieken worden steeds vaker worden kweek afhankelijk methoden nog routinematig en ze worden beschouwd standaardwerkwijzen onder bepaalde omstandigheden. Daarom werd een nieuwe chromogene agar medium getest met als doel het bieden van een betere werkwijze voor isolatie en differentiatie van klinisch relevante Vibrio spp. Het protocol vergeleken de sensitiviteit, specificiteit en detectielimiet voor de detectie van V. parahaemolyticus tussen de nieuwe chromogene medium en een conventioneel medium. Diverse V. parahaemolyticus stammen (n = 22) rede presentatie van diverse serotypes en de bron van oorsprong werden gebruikt. Zij werden eerder geïdentificeerd door de Food and Drug Administration (FDA) en de Centers for Disease Control and Prevention (CDC), en door TLH -PCR in ons laboratorium verder geverifieerd. In ten minste vier afzonderlijke onderzoeken werden deze stammen geënt op de chromogene agar en thiosulfaat-citraat-galzouten sucrose (TCBS) agar, is de aanbevolen medium voor het kweken van deze soort, gevolgd door incubatie bij 35-37 ° C gedurende 24 -96 uur. Drie V. parahaemolyticus stammen (13,6%) niet optimaal groeien op TCBS, toch tentoongesteld groene koloniën als er groei. Twee stammen (9,1%) niet de verwachte cyaan kolonies opleveren op het chromogene agar. Niet- V. parahaemolyticus stammen (n = 32) werden ook getest om de specificiteit van het chromogene agar te bepalen. Onder deze stammen, 31 niet groeien of tentoongesteld andere kolonie morfologie. De gemiddelde herstel van de V. parahaemolyticus op de chromogenic agar was ~ 96,4% betrokken op tryptische soja-agar gesupplementeerd met 2% NaCl. Concluderend, de nieuwe chromogene agar is een effectief medium te detecteren V. parahaemolyticus en het te onderscheiden van andere vibrio.

Introduction

Als lid van het genus Vibrio, V. parahaemolyticus is een Gram-negatieve, niet-sporen-vormende, gebogen, staafvormige bacterie. Vertoont hoge motiliteit in zowel vloeibare en halfvaste omgevingen. De meeste V. parahaemolyticus stammen zijn niet-pathogeen voor mensen, maar de pathogene subtypen veroorzaakt epidemieën en pandemieën, waardoor deze soort wordt beschouwd als een belangrijke voedselpathogeen in veel landen 1,2. De incidentie van Vibrio infectie in de VS heeft een stijgende trend sinds 2000 3. Onder Vibrio spp., V. parahaemolyticus is de meest frequent gemelde soorten veroorzaken ziekten in de VS 4,5. Andere klinisch relevante soorten zijn V. alginolyticus, V. vulnificus, V. cholerae, etc. Een klein percentage van de ziekte wordt veroorzaakt door meerdere soorten tegelijk.

V. parahaemolyticus is een natuurlijke inhabitant van zeewater en dus op grote schaal verspreid in mariene wateren over de hele wereld met inbegrip van de estuaria. De soort werd ontdekt in 1950 na een uitbraak van voedselvergiftiging in Japan. In de VS werd de soort voor het eerst geïsoleerd in zeewater, sedimenten en schelpdieren in de Puget Sound regio 6,7. Filtervoeders in mariene habitats, zoals tweekleppige schelpdieren, kan haven V. parahaemolyticus als onderdeel van hun natuurlijke flora 8. Als zodanig V. parahaemolyticus infecties bij de mens zijn vaak gekoppeld aan de consumptie van besmette vis, vooral rauw of onvoldoende verhit schelpdieren. Een minder gebruikelijke route van binnenkomst optreedt wanneer open wond wordt blootgesteld aan zeewater, waardoor huidinfectie. De meeste V. parahaemolyticus spanningen veroorzaken geen ziekte bij de mens, maar toch bepaalde subtypen herbergen virulentie factoren, zoals thermostabiel direct hemolysine (TDH) zijn pathogeen. De meest voorkomende symptomen van voedselvergiftiging V. parahaemolyticus infectiediarree en buikpijn, gevolgd door misselijkheid, braken, en koorts. Hoofdpijn en koude rillingen zijn ook gemeld. De mediane incubatietijd is 15 uur, maar kan tot 96 uur na consumptie van voldoende hoeveelheid pathogene stammen 9. De ziekte duurt twee tot drie dagen. De gastro symptomen veroorzaakt door V. parahaemolyticus grotendeels zelfbeperkend en daarom speciale behandeling niet nodig. Milde gevallen van gastro-enteritis kunnen worden behandeld door orale rehydratie. Ernstigere ziekten kunnen worden behandeld met antibiotica zoals tetracycline en ciprofloxacine 10. Sterftecijfer ongeveer 2% voor gastro gevallen, maar kan oplopen tot 29% voor die septicemie of sepsis ontwikkelen. Elke persoon die vis consumeert of heeft open wond blootgesteld aan zeewater is het risico van V. parahaemolyticus infectie. De ernstigere vorm van ziekten, levensbedreigende septikemie, komt vaker voor bij een subpopulatie met onderliggende medische conditions 11, die alcoholisme, leverziekte, diabetes, nierziekte, maligniteit en andere omstandigheden die leiden tot een verzwakte immuunrespons omvatten. Met name deze groep van individuen is ook op een hoger risico voor het oplopen van ernstige ziekten veroorzaakt door V. vulnificus, die kan worden gevonden in vergelijkbaar met V. natuurlijke habitats parahaemolyticus.

V. parahaemolyticus wordt routinematig geïsoleerd met behulp van thiosulfaat-citraat-galzouten-sucrose (TCBS) agar als een selectieve en differentiële medium. Verrijking in alkalisch peptonwater kan isolatie voorafgaan op TCBS agar. Vermoedelijke kolonies op TCBS worden verder getest in een reeks van biochemische tests en / of moleculaire assays gericht op de aanwezigheid van soortspecifieke genen. PCR-gebaseerde werkwijzen worden vaak gebruikt om de identiteit van V. bevestigen parahaemolyticus door het versterken van de thermolabiele hemolysin gen, TLH 12.

Ongeacht de lOICE van bevestigingsmethoden, is het belangrijk om een effectief medium te isoleren en te differentiëren V. hebben parahaemolyticus van andere mariene vibrio's in de eerste plaats. TCBS is routinematig gebruikt om soorten differentiëren binnen de genus Vibrio naar vermogen om sucrose 12 gisten. Positieve fermentatie gepaard gaat met een kleurverandering van de pH-indicator broomthymolblauw. V. parahaemolyticus kolonies zijn vrij onderscheidend op TCBS, tentoonstellen blauw naar groen kleur. Dit kan echter niet gemakkelijk onderscheiden medium V. alginolyticus en V. cholerae. sucrose fermenteren Proteus soorten kunnen gele kolonies die lijkt V. produceren cholerae of V. alginolyticus 13. Bij de eerste isolatie op TCBS, V. parahaemolyticus kan ook worden ten onrechte aangemerkt als Aeromonas hydrophila, Plesiomonas shigelloides en Pseudomonas spp 14. Stammen met vertraagde sucrose fermentatie kan worden verward met andere sucrose nonfermenting Vibrio 13, die onder meer V. parahaemolyticus. TCBS bleek ongevoelig tegen Escherichia coli, Pseudomonas putrefaciens, onder anderen. Verscheidene andere soorten op groen naar grijs kolonies die mogelijk worden verward met V. parahaemolyticus of V. vulnificus 15. Dientengevolge is het wenselijk om alternatieve kweekmedia ontwikkelen betere gevoeligheid en specificiteit richting detecteren en isoleren V. parahaemolyticus en andere nauw verwante soorten.

Verschillende media alternatieven zijn recent ontwikkeld. Naast het opnemen van selectiemiddelen meeste nemen chromogene substraten soorten onderscheiden op basis van hun differentiële enzymatische activiteiten. Bijvoorbeeld zijn indoxyl-β-glucoside en indoxyl-β-galactoside gebruikt als chromogene substraten V. differentiëren parahaemolyticus kolonies (die blauw-groen weergegeven) van die van V. cholerae (paars) vanwege hun differentiële vermogen om β-glucosidase en β-galactosidase 16 te produceren. Verschillende formuleringen van chromogene agar ontwikkeld door verschillende groepen onderzocht en gerapporteerd vergelijkbaar of beter dan TCBS 17,18,19 te voeren. Een voordeel van het gebruik van een chromogeen medium is dat het kleuren van het omringende medium minimaal is waardoor de isolatie van bepaalde kolonies vergemakkelijkt. In dit onderzoek onderzochten we de mogelijkheid van een nieuw geformuleerde chromogeen medium voor detecteren en isoleren V. cholerae, V. parahaemolyticus en V. vulnificus; met een speciale focus op het vermogen om onderscheid te maken V. parahaemolyticus van andere soorten.

Protocol

1. Media en het kweken van bacteriestammen LET OP: Gebruik aseptische technieken in alle experimenten. Gebruik steriele materialen. Steriliseren alle containers, instrumenten en reagentia voor gebruik. Autoclaaf alle afvalstoffen voorafgaand aan verwijdering, omdat ze biologisch gevaarlijk worden beschouwd. Autoclaaf temperatuur en tijd combinatie ≥121 ° C x ≥15 min voor elk van de volgende procedures. Om ~ 1-L tryptische soja-agar (TSA), eerste voeg 1 L gedeïoniseerd water …

Representative Results

In deze studie werden 54 microbiële stammen samengesteld die 22 -stammen in de V. parahaemolyticus species, 19 andere Vibrio en 13 niet Vibrio soorten (Tabel 1). De meeste V. parahaemolyticus stammen werden ofwel ontvangen van de FDA, CDC of andere openbare gezondheidszorg afdelingen. Zij vertegenwoordigen verschillende serotypes en isolatie bronnen. Deze stammen werden eerder geïdentificeerd door de regelgevende instanties. We beves…

Discussion

Dit onderzoek richt zich op de ontwikkeling en evaluatie van de cultuur media. Conventioneel TCBS is het selectief en differentieel medium voor de isolatie en het detecteren V. parahaemolyticus, V. cholerae en V. vulnificus 12. Echter zijn beperkingen gerapporteerd voor dit medium, zoals het onvermogen om onderscheid V. cholerae uit andere Vibrio. Sucrose en pH-indicator zijn de differentiatie agenten van TCBS. Aldus zuurproductie sucrose fermentor veroorzaakt kleurverander…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken M. Channey, E. Chau, en K. Tomas voor hun hulp aan het project. Project leveringen werden gedeeltelijk gefinancierd door de California Polytechnic State University.

Materials

Reagent/Equipment
Agar Fisher Scientific DF0140-15-4 may use other brands
Autoclave Any
BHI powder Fisher Scientific DF0418-17-7 may use other brands
Blender Any to blend oyster meat
CampyGen gas generator Hardy Diagnostics CN035A to provide a microaerophilic atmosphere; may use other brands
Chocolate agar plates Hardy Diagnostics E14 may use other brands
Common PCR reagents (dNTPs, MgCl2, Taq Polymerase) Any or use PCR beads (Fisher Sci 46-001-014)
Culture tubes Fisher Scientific S50712 may use other brands
Eppendorf tubes Fisher Scientific S348903 may use other brands
Gel doc Any
HardyChrom Vibrio agar plates Hardy Diagnostics G319 This study evaluates this medium
Incubator Any
Inoculating loops Fisher Scientific 22-363-606 10 microliter-size was used in this study
NaCl Fisher Scientific BP358-212 may use other brands
Oysters Any
PBS Fisher Scientific R23701 may use other brands
Petri dish Fisher Scientific FB0875713 may use other brands
Pipette and tips Any Sterilized tips
Primers for tlh IDT DNA
Scale Any
Spreader Fisher Scientific 08-100-11 Beads may be used instead
Stomacher blender Stomacher 400 Samples were homogenized at 200 rpm for 30 sec.  Other homogenizer can be used.
Sterile filter bags for blenders Fisher Scientific 01-812-5
TCBS powder Hardy Diagnostics 265020 This study evaluates this medium
Thermocycler Any
TSB powder Fisher Scientific DF0370-07-5 may use other brands
UV viewing cabinet Any Emit long-wave UV light
Water bath Any
Name Sources Catalog Number Comments
Bacterial species and strains
Aeromonas hydrophila ATCC
Candida albicans ATCC
Campylobacter jejuni ATCC
Escherichia coli ATCC
Proteus mirabilis ATCC
Pseudomonas aeruginosa ATCC
Staphylococcus aureus ATCC
Salmonella Choleraesuis ATCC
Shigella boydii ATCC
Shigella flexneri ATCC
Shigella sonnei ATCC
Vibrio alginolyticus ATCC
V. cholerae (serotypes include O139, O1, non O1, El Tor biovars) FDA, ATCC
V. damsela FDA
V. fisherii Environment
V. fluvialis CDC
V. furnissii CDC
V. hollisae FDA
V. metschnikovii ATCC
V. mimicus FDA
V. parahaemolyticus(serotypes include O3:K6, O1:K56, O4:K8, O5:K15, O8, etc) ATCC, FDA, CDC, Environment
V. proteolyticus FDA
V. vulnificus FDA

References

  1. Yeung, P. S., Boor, K. J. Epidemiology, pathogenesis, and prevention of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections. Foodborne Pathog. Dis. 1 (2), 74-88 (2004).
  2. Yeung, P. S. M., Boor, K. J., Faruque, S. M. Epidemiology, molecular biology, and detection of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections. Foodborne and Waterborne Bacterial pathogens: Epidemiology, Evolution and Molecular Biology. , 153-184 (2012).
  3. Centers for Disease Control and Prevention. Vital Signs: Incidence and Trends of Infection with Pathogens Transmitted Commonly Through Food – Foodborne Diseases Active Surveillance Network, 10 U.S. Sites, 1996-2010. Morbidity and Mortality Weekly Report. 10, 1996-2010 (2011).
  4. . Summary of human Vibrio cases reported to CDC, 2008 Available from: https://stacks.cdc.gov/view/cdc/21591 (2008)
  5. Scallan, E., et al. Foodborne illness acquired in the United States – major pathogens. Emerg. Infect. Dis. 17 (1), 7-15 (2011).
  6. Baross, J., Liston, J. Occurrence of Vibrio parahaemolyticus and related hemolytic vibrios in marine environments of Washington State. Appl. Microbiol. 20 (2), 179-186 (1970).
  7. Baross, J., Liston, J. Isolation of Vibrio parahaemolyticus from the Northwest Pacific. Nature. 217 (5135), 1263-1264 (1968).
  8. Kueh, C. S., Chan, K. Y. Bacteria in bivalve shellfish with special reference to the oyster. J. Appl. Bacteriol. 59 (1), 41-47 (1985).
  9. Food and Drug Administration. . Bad Bug Book, Foodborne Pathogenic Microorganisms and Natural Toxins. , (2012).
  10. Qadri, F., et al. Adaptive and inflammatory immune responses in patients infected with strains of Vibrio parahaemolyticus. J. Infect. Dis. 187 (7), 1085-1096 (2003).
  11. MacFaddin, J. F. . Media for isolation-cultivation-identification-maintenance of medical bacteria. 1, (1985).
  12. Bottone, E. J., Robin, T. Vibrio parahaemolyticus: suspicion of presence based on aberrant biochemical and morphological features. J. Clin. Microbiol. 8 (6), 760-763 (1978).
  13. Lotz, M. J., Tamplin, M. L., Rodrick, G. E. Thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose agar and its selectivity for clinical and marine vibrio organisms. Ann. Clin. Lab. Sci. 13 (1), 45-48 (1983).
  14. Hara-Kudo, Y., Nishina, T., Nakagawa, H., Konuma, H., Hasegawa, J., Kumagai, S. Improved method for detection of Vibrio parahaemolyticus in seafood. Appl. Environ. Microbiol. 67 (12), 5819-5823 (2001).
  15. Eddabra, R., Piemont, Y., Scheftel, J. M. Evaluation of a new chromogenic medium, chromID Vibrio, for the isolation and presumptive identification of Vibrio choleare and Vibrio parahaemolyticus from human clinical specimens. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 30 (6), 733-737 (2011).
  16. Kodaka, H., Teramura, H., Mizuochi, S., Saito, M., Matsuoka, H. Evaluation of the Compact Dry VP method for screening raw seafood for total Vibrio parahaemolyticus. J. Food. Prot. 72 (1), 169-173 (2009).
  17. Su, Y. C., Duan, J., Wu, W. H. Selectivity and specificity of a chromogenic medium for detecting Vibrio parahaemolyticus. J. Food Prot. 68 (7), 1454-1456 (2005).
  18. Bej, A. K., Patterson, D. P., Brasher, C. W., Vickery, M. C., Jones, D. D., Kaysner, C. A. Detection of total and hemolysin-producing Vibrio parahaemolyticus in shellfish using multiplex PCR amplification of tl, tdh and trh. J. Microbiol. Methods. 36 (3), 215-225 (1999).
  19. Yeung, P. S. M., DePaola, A., Kaysner, C. A., Boor, K. J. A PCR assay for specific detection of the pandemic Vibrio parahaemolyticus O3:K6 clone from shellfish. J. Food Sci. 68 (4), 1459-1466 (2003).
  20. Yeung, P. S. M., Hayes, M. C., DePaola, A., Kaysner, C. A., Kornstein, L., Boor, K. J. Comparative phenotypic, molecular, and virulence characterization of Vibrio parahaemolyticus O3:K6 isolates. Appl. Environ. Microbiol. 68 (6), 2901-2909 (2002).
  21. Duan, J., Su, Y. -. C. Comparison of a chromogenic medium with thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose agar for detecting Vibrio parahaemolyticus. J. Food Sci. 70, M125-M128 (2005).
  22. Pinto, A. D., Terio, V., Novello, L., Tantillo, G. Comparison between thiosulphate-citrate-bile salt sucrose (TCBS) agar and CHROMagar Vibrio for isolating Vibrio parahaemolyticus. Food Control. 22 (1), 124-127 (2011).
  23. Canizalez-Roman, A., Flores-Villaseñor, H., Zazueta-Beltran, J., Muro-Amador, S., Leòn-Sicairos, N. Comparative evaluation of a chromogenic agar medium-PCR protocol with a conventional method for isolation of Vibrio parahaemolyticus strains from environmental and clinical samples. Can J Microbiol. 57 (2), 136-142 (2011).
  24. Kriem, M. R., et al. Prevalence of Vibrio spp. in raw shrimps (Parapenaeus longirostris) and performance of a chromogenic medium for the isolation of Vibrio strains. Lett Appl Microbiol. 61 (3), 224-230 (2015).
  25. Food Drug Administration. Statistical guidance on reporting results from studies evaluating diagnostic tests. http://www.fda.gov/RegulatoryInformation/Guidances/ucm071148.htm. , (2007).
  26. Burd, E. M. Validation of laboratory-developed molecular assays for infectious diseases. Clin Microbiol Rev. 23 (3), 550-576 (2010).

Play Video

Cite This Article
Yeung, M., Thorsen, T. Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species. J. Vis. Exp. (117), e54493, doi:10.3791/54493 (2016).

View Video