Reinigung von nativem Komplexe für die Strukturstudie ein Tandem Affinity Tag-Methode unter Einsatz
Summary
The Tandem Affinity Purification (TAP) method has been used extensively to isolate native complexes from cellular extract, primarily eukaryotic, for proteomics. Here, we present a TAP method protocol optimized for purification of native complexes for structural studies.
Abstract
Affinitätsreinigung Ansätze wurden erfolgreich für Proteomik Charakterisierung zu isolieren nativen Komplexe. Strukturelle Heterogenität und ein gewisses Maß an Heterogenität der Zusammensetzung eines Komplexes nicht behindern in der Regel Fortschritte in solchen Studien durch. Im Gegensatz dazu ist ein Komplex für die strukturelle Charakterisierung bestimmt sind, sollten in einem Zustand gereinigt werden, die sowohl kompositionell und strukturell homogener als auch in einer höheren Konzentration als für die Proteomik erforderlich ist. Seit kurzem gibt es für die Strukturbestimmung großer makromolekularer Komplexe in der Anwendung von Elektronenmikroskopie signifikante Fortschritte. Dies hat das Interesse an Ansätzen erhöhte auf native Komplexe von ausreichender Qualität und Quantität für die Strukturbestimmung mittels Elektronenmikroskopie zu reinigen. Die Tandem Affinity Purification (TAP) Verfahren optimiert wurde , um eine 18-Untereinheit, ~ 0,8 MDa ribonucleoprotein Montage von Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae) zu extrahieren und zu reinigen </em> geeignet für negative Färbung und Elektronen Kryo-Mikroskopie. Hierbei wird detailliert die an die TAP-Methode vorgenommenen Änderungen, die Gründe für diese Änderungen vorgenommen haben, und die Ansätze für eine kompositorisch und strukturell homogenen Komplex Assay genommen.
Introduction
Viele wichtige zelluläre Prozesse werden 1 von großen Protein- und Protein-RNA – Komplexen durchgeführt. Ein wesentlicher Engpass biophysikalische und strukturelle Untersuchungen solcher Komplexe zur Durchführung wird sie in geeigneter Qualität (dh Homogenität) und in einer geeigneten Konzentration zu erhalten. Isolieren eines Komplexes aus einer natürlichen Quelle hat viele Vorteile, einschließlich der Beibehaltung relevanten posttranskriptionales und / oder translationale Modifikationen von Untereinheiten und die richtige komplexe Montage sicherstellt. Jedoch sind große Zellkomplexe oft in einer Zelle bei einer niedrigen Kopienzahl und die Reinigung müssen unter nahezu physiologischen Bedingungen sehr leistungsfähig und treten komplex Integrität sicherzustellen aufrechterhalten wird. Reinigung eines Komplexes aus einer eukaryotischen Quelle ist eine besondere Herausforderung und kann finanziell untragbar sein. So Strategien oder Methoden, die eine homogene komplexe effiziente und ergeben sind sehr erwünscht.
Eine Strategie, die warerfolgreiche einheimische Komplexe aus eukaryotischen Zellen für ihre anfängliche Charakterisierung bei der Reinigung ist die Tandem Affinity Purification (TAP) Methode 2,3. Die TAP – Methode wurde zunächst mit zusammenwirkenden Faktor (en) 2 ein natives Protein aus der Bäckerhefe (S. cerevisiae) in Komplex zu reinigen , erdacht. Die TAP-Methode zwei Tags verwendet, jedes Tag in tandem mit dem gleichen Protein-kodierenden Gensequenz fusioniert. Die Tags wurden so ausgewählt, dass eine Notwendigkeit für enge und selektive Bindung an ein Affinitätsharz mit dem Wunsch, in der Nähe von physiologischen Lösung Bedingungen aufrechtzuerhalten auszubalancieren. Diese Balance dient, mit zusammenwirkenden Faktor (en) für die Nachreinigung Charakterisierung stabile Wechselwirkung (en) des markierten Proteins zu bewahren. Die genomisch integriert TAP-Tag am Ende (C-terminal) einer Protein-kodierenden Gens plaziert wurde, und bestand aus einer Sequenz, codierend für ein Calmodulin bindendes Peptid (CBP), gefolgt von einer Protein – ein Zusatz von etwas mehr als 20 kDa zu dem markierten Eiweiß. CBP ist kurz, 26 Aminosäuren und durch die ~ 17 kDa Protein Calmodulin (CaM) in Gegenwart von Calcium mit einem K D in der Größenordnung von 10 -9 M 4 erfasst. Das Protein A-Tag größer ist, bestehend aus zwei Wiederholungen von 58 Resten mit einer kurzen Linker zwischen den Wiederholungen. Jeweils 58 Aminosäure repeat wird durch Immunglobulin G (IgG) mit einer K D ~ 10 -8 M 5 erfasst. Zwischen diesen beiden Tags wurde eine Erkennungsstelle für TEV – Protease eingebaut, eine Endopeptidase aus dem Tabakätzvirus 6,7. Wie in Figur 1 dargestellt ist , in der ersten Affinitätsschritt des Verfahrens wird die TAP – Protein markiert ist mit einem IgG – Harz über das Protein A gebunden Das markierte Protein , das durch Spaltung an der Säule bei der Zugabe von TEV – Protease eluiert, ortsspezifisch zu spalten zwischen die beiden Tags. Dies ist ein notwendiger Schritt, da die Interaktion von IgG und Protein A ist sehr stark und nur hinreichend unter denaturierenden Lösungsbedingungen gestört werden kann. In Ermangelung eines Protein : Tag wird das Protein zu CaM Harz in Gegenwart von Calcium gebunden und aus diesem Harz unter Zugabe des Metallionenchelator EGTA (Ethylenglykoltetrasäure) (Abbildung 1) eluiert.
Bald nach der Einführung des TAP – Methode, es in einer groß angelegten Studie verwendet wurde , eine "Karte" der komplexen Wechselwirkungen in S. zu erzeugen cerevisiae 8. Wichtig ist markiert, als Folge dieser Bemühungen eine ganze Hefe-TAP Tagged Open Reading Frame (ORF) Bibliothek sowie einzelne TAP ORFs 9 von einer kommerziellen Quelle erhältlich sind. Somit kann man jede Hefestamm mit einem markierten Proteins für jede Hefe-Komplex erhalten. Die TAP – Verfahren angetrieben auch Modifikationen oder Variationen des TAP – Tag, einschließlich: seine Verwendung zur Reinigung von Komplexen aus anderen eukaryotischen als auch Bakterienzellen 10,11; der Entwurf eines "Split – Tag", bei dem das Protein A und CBP auf verschiedene Proteine 12 platziert sind; und tags verändert, um so die Notwendigkeit des Prüfers, wie Empfindlichkeit des Komplexes zu Ca 2+ oder EGTA 13 aufzunehmen.
Jüngste Fortschritte in sowohl Instrumentierung und Methodik haben zu erheblichen Fortschritten bei der Anwendung der Elektronenmikroskopie (EM) führte zur Strukturbestimmung, die zu hohen, in der Nähe von atomarer Auflösung Bilder von makromolekularen Komplexen 14 geführt. Die erreichbare Auflösung eines Komplexes von EM bleibt jedoch, die von der Qualität des Komplexes untersucht. Diese Studie hat die TAP – Tag Ansatz genutzt von S. zu reinigen cerevisiae die U1 snRNP, ein 18-Untereinheit (~ 0,8 MDA) geringer Kopienzahl Ribonukleoproteinkomplex , die Teil des Spliceosoms 15,16 ist. Eine Reihe von Schritten wurden unternommen, um diesen Komplex zu reinigen, so daß sie homogen und einer ausreichenden Konzentration vorliegt. Potenzielle Probleme in verschiedenen Stadien der Reinigung begegnet werden beschrieben und Strategien chall zu überwinden ergriffenEnges hervorgehoben. Durch die sorgfältige Bewertung und Schritte bei der Reinigung zu optimieren, gereinigt das U1 snRNP ist von einer Qualität und einer Menge geeignet für negative Färbung und Elektronen Kryo (Kryo-EM) Studien. Eine optimierte TAP Methode Protokoll für die Reinigung von nativen Komplexe für Strukturuntersuchungen wird hier beschrieben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die TAP-Methode verwendet zwei Tags, die eine Notwendigkeit für strenge und selektive Bindung an ein Affinitätsharz mit dem Wunsch, in der Nähe von physiologischen Lösung Bedingungen aufrechtzuerhalten leichen. Diese Balance dient, mit zusammenwirkenden Faktor (en) für die Nachreinigung Charakterisierung stabile Wechselwirkung (en) des markierten Proteins zu bewahren. Darüber hinaus markiert einzelne TAP ORFs von einer kommerziellen Quelle erhältlich sind, so dass man jeden Hefestamm mit einem markierten Proteins…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors are grateful for the support and advice of Nikolaus Grigorieff. We thank Anna Loveland, Axel Brilot, Chen Xu, and Mike Rigney for helpful discussions and EM guidance. This work was funded by the National Science Foundation, Award No. 1157892. The Brandeis EM facility is supported by National Institutes of Health grant P01 GM62580.
Materials
| S. cerevisiae TAP tagged strain | Open Biosystems | YSC1177 | This is the primary yeast strain used to develop the TAP protocol. Its background is S288C: ATCC 201388: MATa, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0, SNU71::TAP::HIS3MX6 |
| Coffee grinder | Mr. Coffee | IDS77 | Used for cell lysis |
| Hemocytometer, Bright Line | Hausser Scientific | 3120 | Used to assess cell lysis |
| JA 9.100 centrifuge rotor | Beckman Coulter, Inc. | Used to harvest the yeast cells | |
| JA 20 fixed-angle centrifuge rotor | Beckman Coulter, Inc. | Used to clear the cell extract of non-soluble cellular material | |
| Ti 60 fixed-angle centrifuge rotor | Beckman Coulter, Inc. | Used to further clear the soluble cell extract | |
| Thermomixer | Eppendorf | R5355 | Temperature controlled shaker |
| Novex gel system | Thermo Fisher Scientific | ||
| IgG resin | GE Healthcare | 17-0969-01 | Sepharose 6 fast flow |
| Calmodulin resin | Agilent Technologies, Inc. | 214303 | Affinity resin |
| Protease inhibitor cocktail, mini tablets | Sigma Aldrich | 589297 | Mini cOmplete ultra EDTA-free tablets |
| Protease inhibitor cocktail, large tablets | Sigma Aldrich | 5892953 | cOmplete ultra EDTA-free tablets |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Dissolved in isopropanol | ||
| 2 mL Bio-spin column | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 7326008 | Used to pack and wash the Calmodulin resin |
| 10 mL poly-prep column | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 7311550 | Used to pack and wash the IgG resin |
| Precast native PAGE Bis-Tris gels | Life Technologies | BN1002 | Novex NativePAGE Bis-Tris 4-16% precast polyacrylamide gels |
| NativeMark protein standard | Thermo Fisher Scientific | LC0725 | Unstained protein standard used for native PAGE. Load 7.5 μL for a silver stained gel and 5 μL for a SYPRO Ruby stained gel |
| Precast SDS PAGE Bis-Tris gels | Life Technologies | NP0321 | Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4-12% precast polyacrylamide gels |
| PageRuler protein standard | Thermo Fisher Scientific | 26614 | Unstained protein standard used for Western blotting |
| SDS running buffer | Life Technologies | NP0001 | 1x NuPAGE MOPS SDS Buffer |
| TAP antibody | Thermo Fisher Scientific | CAB1001 | Primary antibody against CBP tag |
| Secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | 31341 | Goat anti-rabbit alkaline phosphatase conjugated |
| BCIP/NBT | Thermo Fisher Scientific | 34042 | 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitro blue tetrazolium |
| Dialaysis units | Thermo Fisher Scientific | 88401 | Slide-A-Lyzer mini dialysis units |
| Centrifugal filter units, 100kDa MWCO | EMD Millipore | UFC5100008 | Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane |
| Detergent absorbing beads | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1523920 | Bio-bead SM-2 absorbants |
| SYBR Green II | Thermo Fisher Scientific | S-7564 | Flourescent dye for nucleic acid staining, when detecting with SYPRO Ruby present, use excitation wavelength of 488 nm and emission wavelength of 532 nm |
| SYPRO Ruby | Molecular Probes | S-12000 | Flourescent dye for protein staining, when detecting with SYBR Green II present, use excitation wavelength of 457 nm and emission wavelength of 670 nm |
| Copper grids | Electron Microscopy Sciences | G400-CP |
References
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