Summary

Affidabile e di alta efficienza di estrazione del rene cellule immunitarie

Published: August 19, 2016
doi:

Summary

Techniques that are reliable and efficient for the isolation of kidney immune cells are needed for downstream applications. This requires surface antibody labeling of a small number of kidney immune cells. Herein, we describe a concise method for isolation of kidney immune cells that seemingly achieves this goal.

Abstract

Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes. The immune system consists of both adaptive and innate components and multiple cell types. Sometimes, the cell type of interest is present in very low numbers among the large numbers of total cells isolated from the kidney. Hence, reliable and efficient isolation of kidney mononuclear cell populations is important in order to study the immunological problems associated with kidney diseases. Traditionally, tissue isolation of kidney mononuclear cells have been performed via enzymatic digestions using different varieties and strengths of collagenases/DNAses yielding varying numbers of viable immune cells. Recently, with the development of the mechanical tissue disruptors for single cell isolation, the collagenase digestion step is avoided and replaced by a simple mechanical disruption of the kidneys after extraction from the mouse. Herein, we demonstrate a simple yet efficient method for the isolation of kidney mononuclear cells for every day immune cell extractions. We further demonstrate an example of subset analysis of immune cells in the kidney. Importantly, this technique can be adapted to other soft and non-fibrous tissues such as the liver and brain.

Introduction

Attivazione del sistema immunitario si verifica in molteplici malattie renali e processi fisiopatologici 6,10,11,13. Potenziali aree di ricerca attiva comprendono vari inneschi per l'attivazione del sistema immunitario, vari tipi cellulari coinvolti, il pattern di citochine / chemochine in una particolare impostazione di malattia, la modulazione di tutti i processi sopra menzionati un particolare farmaco ecc Per esemplificare, in ischemia-riperfusione lesioni (un modello di danno renale acuto), vi è un aumento delle cellule immuni o di midollo osseo derivate cellule ematopoietiche o cellule CD45 + in poche ore, che è sostenuto attraverso il periodo di riparazione o fibrosi (6 settimane dopo) 5, 12. Queste cellule immunitarie secernono entrambe le citochine e chemochine pro-infiammatorie e anti-infiammatori per orchestrare il processo di riparazione 5,12. Attualmente, la possibilità di utilizzare più fluorofori contemporaneamente etichettare popolazioni di cellule in una sospensione singola cella è aumentata con l'annunciosfiato di flusso moderna citometria a macchine con quattro o cinque laser. Ciò ha sostanzialmente aggiunto alla capacità di discriminare le popolazioni cellulari in base al loro stato funzionale 3,7. Ad esempio, per etichettare con precisione un macrofago come F4 / 80 basso alto alto CD206 CD11b Ly6b basso, almeno altre 3 fluorofori sarebbe necessaria nello stesso volume del campione alla porta per le cellule vive, CD45 + (leucociti) e Ly6G- (neutrofili) e questo è molto possibile con il più recente flusso Citometri 3. Tuttavia, i saggi a valle per la secrezione di citochine, proliferazione cellulare, citotossicità, attivazione dei macrofagi e la quantificazione del numero di vari sottoinsiemi di linfociti e monociti non ha bisogno solo di buona qualità (cellule vive, canottiere) ma un numero adeguato di cellule.

Il sistema immunitario nel rene è costituito da due componenti adattivi e innate e più tipi di cellule 1,7,13. Ad esempio, nei topi due kidneys insieme sono segnalati per contenere 2-17% (28,000-266,000) CD45 + cellule delle cellule immunitarie renali totale isolate (1,4 x 10 6 cellule) e circa il 5-15% (1,400-4,200) di queste sono cellule CD4 + 1 , 5,12. Una piccola percentuale (5-15%, 70-630) di queste cellule CD4 + sono FOXP3 cellule + (Figura 1) 1. A causa di queste passo saggio riduzioni percentuali di cellule, a volte la popolazione di cellule (in questo caso CD45 + CD4 + FoxP3 + cellule) è rappresentato da una semplice ~ 100 cellule. Il piccolo numero di FOXP3 cellule CD45 + CD4 + + rende imperativo che un gran numero di cellule totali sono isolati e le cellule sono di buona qualità per gli studi a valle, come test di secrezione di citochine. Inoltre, può essere necessario combinare reni da 2-3 topi poiché le sottopopolazioni non sono rappresentati in numero sufficientemente elevate per eseguire saggi quantificabili. Pertanto, l'isolamento affidabile ed efficiente di popolazioni di cellule mononucleate rene è auspicabile per vite prigionieray lo spettro immunologica associata a malattie renali.

Tradizionalmente, per l'isolamento delle cellule mononucleari del rene, i ricercatori hanno utilizzato una varietà di digestioni enzimatiche quali 1A collagenasi o II compreso DNasi 1 1,5,12. È ben noto che collagenasi hanno attività enzimatica che varia con numeri di lotto e per società di produzione, che richiede la titolazione per la concentrazione ottimale e durata dell'incubazione 4,14,15. Inoltre, la digestione con collagenasi aggiunge tempo per tritare il rene in piccoli pezzi, necessita incubazione dei pezzi rene in un bagno riscaldato (37 ° C) ed il tempo supplementare per incubazione in EDTA per fermare la reazione. Inoltre, meno sterilità può essere ottenuto ad alcune procedure valle necessitano coltura cellulare. Ancora più importante, a seconda del ricercatore e tutte le variabili coinvolte, porta alla variabilità dei dati e l'interpretazione di tutti i laboratori. Recentemente, con lasviluppo di meccanici tessuto Disgregatori / omogeneizzatori 16, la fase di collagenasi digestione viene completamente evitato e sostituito da un semplice distruzione meccanica dei reni 2. Qui, dimostriamo un metodo semplice ma efficace per l'isolamento delle cellule immunitarie di rene per tutti i giorni estrazioni cellule immunitarie. È importante sottolineare che questa tecnica può essere adattato ad altri tessuti molli e non fibrose come il fegato e il cervello 16.

Protocol

Tutte le fasi del protocollo eseguiti sono stati esaminati e approvati dalla University of Missouri cura degli animali e del Comitato uso (ACUC). Per questo protocollo, maschi C57BL / 6 topi di età compresa tra 15 settimane sono stati utilizzati anche se teoricamente qualsiasi roditore a qualsiasi età può essere utilizzato per gli esperimenti. Poiché questo è un intervento chirurgico non-sopravvivenza, l'eutanasia si ottiene dissanguamento e pneumotorace bilaterale. 1. perfusione dei …

Representative Results

Il numero di pannelli che possono essere eseguiti dipende dal numero di cellule immunitarie che possono essere estratti in modo affidabile dai reni. Qui, dimostriamo la capacità di eseguire 2 pannelli, uno per i linfociti T e uno per i macrofagi / cellule dendritiche. Sul pannello dei linfociti T, dobbiamo prima guardare al forward scatter (FSC) e side scatter modello (SSC) e delineare la popolazione di interesse come mostrato in Figura 1 (dot plot in alto a sinistra). …

Discussion

Abbiamo presentato qui un metodo per ottenere cellule immunitarie dal rene in modo affidabile ed efficiente. La modifica principale al passaggio digestione collagenasi ampiamente utilizzato (rottura meccanica del tessuto) risparmiare circa 30 min e l'isolamento di un gran numero di cellule immunitarie vitali richiede meno di due ore per 4 campioni renali. Inoltre, a seconda della nostra domanda di ricerca, ora usiamo un solo rene (l'altro rene può essere utilizzato per l'analisi delle proteine ​​da West…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work is supported by a Research Grant from Dialysis Clinics Inc. and from the University of Missouri Research Board Grant.

Materials

Stomacher 80 Biomaster lab system Seward
Stomacher 80 Classic bags Seward BA6040/STR
Sorvall Legend XFR Centrifuge Thermo Scientific Or equivalent equipment 
Hemocytometer Electron Microscopy Sciences 63514-11
Analytical flow cytometer BD LSR-X20 Fortessa
Percoll  Sigma P1644
Dulbecco’s phosphate buffered saline 1X (DPBS) Gibco, Life Technologies 14190-250
Polypropylene tubes, no cap Becton Dickinson 352002
Fixable Viability Stain BD Biosciences  FVS510,  564406
Anti-CD16/32 (Clone: 93) EBioscience 14-0161
anti-CD45 (clone: 30-F11)  BV421  BD Pharmingen 103133/4
Anti-Foxp3 (Clone: FJK-16s) APC EBioscience 17-5773
Anti-CD127 (Clone: A7R34) PE/Cy7 Biolegend 135013/4
anti-CD44 (Clone: IM7) PerCP/Cy5.5 Biolegend 103031/2
anti-CD4 (Clone: RM4-5) APC-Cy7 Biolegend 100413/4
anti-CD8 (Clone: 53-6.7) BV785 Biolegend 100749/50
Anti-Ly6G (Clone: 1A8) FITC Biolegend 127605/6
Anti-CD11b (Clone: M1/70) PerCP-Cy5.5 Biolegend 101227/8
Anti-F4/80 (Clone: BM8) APC Biolegend 123115/6
Anti-CD11c (Clone: N418) BV785 Biolegend 117335/6
Anti-CD301 (Clone: LOM-14) PE-Cy7 Biolegend 145705/6
Anti-CD26 (Clone: H194-112) PE Biolegend 137803/4
100 μm filter  Fisher Scientific 22363548
Fisherbrand Tubes 50 ml Fisher Or equivalent equipment 
Fisherbrand Tubes 15 ml Fisher Or equivalent equipment 
Sucrose Fisher chemical S5-3
Transfer pipette fine tip Samco Scientific 232 Or equivalent equipment 
Flow Cytometery Staining Buffer Solution EBioscience 00-4222-26 Or equivalent equipment 
1X RBC Lysis Buffer EBioscience 00-4333-57 Or equivalent equipment 

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Cite This Article
Nistala, R., Meuth, A., Smith, C., Annayya, A. Reliable and High Efficiency Extraction of Kidney Immune Cells. J. Vis. Exp. (114), e54368, doi:10.3791/54368 (2016).

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