Extraction d'efficacité fiable et haute du rein cellules immunitaires
Summary
Techniques that are reliable and efficient for the isolation of kidney immune cells are needed for downstream applications. This requires surface antibody labeling of a small number of kidney immune cells. Herein, we describe a concise method for isolation of kidney immune cells that seemingly achieves this goal.
Abstract
Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes. The immune system consists of both adaptive and innate components and multiple cell types. Sometimes, the cell type of interest is present in very low numbers among the large numbers of total cells isolated from the kidney. Hence, reliable and efficient isolation of kidney mononuclear cell populations is important in order to study the immunological problems associated with kidney diseases. Traditionally, tissue isolation of kidney mononuclear cells have been performed via enzymatic digestions using different varieties and strengths of collagenases/DNAses yielding varying numbers of viable immune cells. Recently, with the development of the mechanical tissue disruptors for single cell isolation, the collagenase digestion step is avoided and replaced by a simple mechanical disruption of the kidneys after extraction from the mouse. Herein, we demonstrate a simple yet efficient method for the isolation of kidney mononuclear cells for every day immune cell extractions. We further demonstrate an example of subset analysis of immune cells in the kidney. Importantly, this technique can be adapted to other soft and non-fibrous tissues such as the liver and brain.
Introduction
L' activation du système immunitaire se produit dans les maladies rénales et les multiples processus physiopathologiques 6,10,11,13. Les domaines potentiels de recherche active englobent les différents déclencheurs pour l'activation du système immunitaire, divers types de cellules impliquées, le motif cytokine / chimiokine dans un cadre particulier de la maladie, la modulation de tous les processus mentionnés ci-dessus par un médicament en particulier, etc. Pour illustrer, dans l'ischémie-reperfusion blessure (un modèle pour lésions rénales aiguës), il y a une augmentation dans les cellules immunitaires ou de moelle osseuse provenant des cellules hématopoïétiques ou CD45 + cellules en quelques heures, qui est soutenue par la période de réparation ou de fibrose (6 semaines plus tard) 5, 12. Ces cellules immunitaires sécrètent les cytokines et les chimiokines pro-inflammatoires et anti-inflammatoires pour orchestrer le processus de réparation 5,12. Actuellement, la possibilité d'utiliser simultanément plusieurs fluorophores pour étiqueter des populations de cellules dans une suspension cellulaire unique a augmenté avec l'annoncevent d'écoulement moderne cytométrie machines avec quatre à cinq lasers. Ceci a ajouté sensiblement à la capacité de distinguer les populations de cellules en fonction de leur état de fonctionnement 3,7-. Par exemple, pour marquer avec précision un macrophage comme F4 / 80 basses CD11b haute Ly6b haute CD206 bas, au moins 3 autres fluorophores serait nécessaire dans le même volume d'échantillon à la porte pour les cellules vivantes, CD45 + (leucocytes) et Ly6G- (neutrophiles) et cela est tout à fait possible avec la nouvelle débit Cytometers 3. Cependant, les dosages en aval pour la sécrétion de cytokines, la prolifération cellulaire, la cytotoxicité, l'activation des macrophages et la quantification du nombre de différents sous-ensembles de lymphocytes et de monocytes n'a besoin pas de bonne qualité (cellules vivantes, singulets), mais un nombre suffisant de cellules.
Le système immunitaire dans le rein est constitué de deux composantes adaptatives et innée et plusieurs types de cellules 1,7,13. Par exemple, chez la souris les deux enfantsNeys sont ensemble rapporté pour contenir 2-17% (28,000-266,000) CD45 + cellules du rein totale des cellules immunitaires isolées (1,4 x 10 6 cellules) et environ 5-15% (1,400-4,200) de ceux – ci sont des cellules CD4 + 1 , 5,12. Un faible pourcentage (5-15%, 70-630) de ces cellules CD4 + sont FoxP3 + cellules (Figure 1) 1. En raison de ces réductions de pas sages en pourcentage de cellules, parfois la population cellulaire d'intérêt (dans ce cas CD45 + CD4 + Foxp3 + cellules) est représenté par un simple ~ 100 cellules. Le petit nombre de CD45 + CD4 + FoxP3 cellules +, il est impératif qu'un grand nombre de cellules totales sont isolées et les cellules sont de bonne qualité pour des études en aval, tels que des dosages de cytokines de sécrétion. En outre, il peut être nécessaire de combiner les reins 2-3 souris étant donné que les sous-populations ne sont pas représentés en nombre suffisamment élevé pour effectuer des dosages quantifiables. Par conséquent, l'isolement fiable et efficace des populations de cellules rénales mononucléaires est souhaitable afin de goujony le spectre immunologique associé à des maladies du rein.
Traditionnellement, pour l' isolement des cellules rénales mononucléaires, les chercheurs ont utilisé une variété de digestions enzymatiques telles que la collagénase 1A ou II y compris DNase 1 1,5,12. Il est bien connu que les collagénases ont une activité enzymatique qui varie en fonction des numéros de lot et par la société de fabrication, ce qui nécessite un titrage de la concentration optimale et la durée d'incubation 4,14,15. En outre, la digestion avec de la collagénase ajoute du temps pour hacher le rein en petits morceaux, nécessite l'incubation des morceaux de rein dans un (37 ° C), un bain chauffé et du temps supplémentaire pour l'incubation dans de l'EDTA pour arrêter la réaction. En outre, moins la stérilité peut être obtenue par certaines procédures en aval nécessitant une culture cellulaire. Plus important encore, selon l'enquêteur et toutes les variables impliquées, elle conduit à la variabilité des données et l'interprétation dans les laboratoires. Récemment, avec ledéveloppement de tissus mécaniques Perturbateurs / Homogéniéisateurs 16, l'étape de digestion de la collagénase est complètement évitée et remplacée par une rupture mécanique simple des reins 2. Ici, nous démontrons une méthode simple et efficace pour l'isolement des cellules immunitaires rénales pour les extractions de cellules immunitaires de tous les jours. Surtout, cette technique peut être adaptée à d' autres tissus mous et non fibreux tels que le foie et le cerveau 16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons présenté ici une méthodologie pour obtenir des cellules immunitaires du rein d'une manière fiable et efficace. La principale modification à l'étape de digestion par la collagénase largement utilisée (rupture mécanique du tissu) permet d'économiser environ 30 minutes et l'isolement d'un grand nombre de cellules immunitaires viables prend moins de deux heures pour les 4 échantillons de rein. En outre, en fonction de notre question de recherche, nous avons maintenant seulement util…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported by a Research Grant from Dialysis Clinics Inc. and from the University of Missouri Research Board Grant.
Materials
| Stomacher 80 Biomaster lab system | Seward | ||
| Stomacher 80 Classic bags | Seward | BA6040/STR | |
| Sorvall Legend XFR Centrifuge | Thermo Scientific | Or equivalent equipment | |
| Hemocytometer | Electron Microscopy Sciences | 63514-11 | |
| Analytical flow cytometer | BD LSR-X20 Fortessa | ||
| Percoll | Sigma | P1644 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline 1X (DPBS) | Gibco, Life Technologies | 14190-250 | |
| Polypropylene tubes, no cap | Becton Dickinson | 352002 | |
| Fixable Viability Stain | BD Biosciences | FVS510, 564406 | |
| Anti-CD16/32 (Clone: 93) | EBioscience | 14-0161 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) BV421 | BD Pharmingen | 103133/4 | |
| Anti-Foxp3 (Clone: FJK-16s) APC | EBioscience | 17-5773 | |
| Anti-CD127 (Clone: A7R34) PE/Cy7 | Biolegend | 135013/4 | |
| anti-CD44 (Clone: IM7) PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 103031/2 | |
| anti-CD4 (Clone: RM4-5) APC-Cy7 | Biolegend | 100413/4 | |
| anti-CD8 (Clone: 53-6.7) BV785 | Biolegend | 100749/50 | |
| Anti-Ly6G (Clone: 1A8) FITC | Biolegend | 127605/6 | |
| Anti-CD11b (Clone: M1/70) PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 101227/8 | |
| Anti-F4/80 (Clone: BM8) APC | Biolegend | 123115/6 | |
| Anti-CD11c (Clone: N418) BV785 | Biolegend | 117335/6 | |
| Anti-CD301 (Clone: LOM-14) PE-Cy7 | Biolegend | 145705/6 | |
| Anti-CD26 (Clone: H194-112) PE | Biolegend | 137803/4 | |
| 100 μm filter | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Fisherbrand Tubes 50 ml | Fisher | Or equivalent equipment | |
| Fisherbrand Tubes 15 ml | Fisher | Or equivalent equipment | |
| Sucrose | Fisher chemical | S5-3 | |
| Transfer pipette fine tip | Samco Scientific | 232 | Or equivalent equipment |
| Flow Cytometery Staining Buffer Solution | EBioscience | 00-4222-26 | Or equivalent equipment |
| 1X RBC Lysis Buffer | EBioscience | 00-4333-57 | Or equivalent equipment |
References
- Ascon, D. B., et al. Phenotypic and functional characterization of kidney-infiltrating lymphocytes in renal ischemia reperfusion injury. J. Immunol. 177 (5), 3380-3387 (2006).
- Ascon, M., et al. Renal ischemia-reperfusion leads to long term infiltration of activated and effector-memory T lymphocytes. Kidney Int. 75 (5), 526-535 (2009).
- Belliere, J., et al. Specific macrophage subtypes influence the progression of rhabdomyolysis-induced kidney injury. J. Am. Soc. Nephrol. 26 (6), 1363-1377 (2015).
- Chen, Z., et al. Collagenase digestion down-regulates the density of CD27 on lymphocytes. J. Immunol. Methods. 413, 57-61 (2014).
- Dong, X., et al. Resident dendritic cells are the predominant TNF-secreting cell in early renal ischemia-reperfusion injury. Kidney Int. 71 (7), 619-628 (2007).
- Hickey, F. B., Martin, F. Diabetic kidney disease and immune modulation. Curr. Opin. Pharmacol. , (2013).
- Kawakami, T., et al. Resident renal mononuclear phagocytes comprise five discrete populations with distinct phenotypes and functions. J. Immunol. 191 (6), 3358-3372 (2013).
- Liu, X., et al. Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners. Exp. Ther. Med. 5 (5), 1322-1326 (2013).
- Picot, J., Guerin, C. L., Le Van, K. C., Boulanger, C. M. Flow cytometry: retrospective, fundamentals and recent instrumentation. Cytotechnology. 64 (2), 109-130 (2012).
- Ricardo, S. D., van, G. H., Eddy, A. A. Macrophage diversity in renal injury and repair. J. Clin. Invest. 118 (11), 3522-3530 (2008).
- Rodriguez-Iturbe, B., Pons, H., Herrera-Acosta, J., Johnson, R. J. Role of immunocompetent cells in nonimmune renal diseases. Kidney Int. 59 (5), 1626-1640 (2001).
- Vielhauer, V., et al. Efficient renal recruitment of macrophages and T cells in mice lacking the duffy antigen/receptor for chemokines. Am. J. Pathol. 175 (1), 119-131 (2009).
- Weisheit, C. K., Engel, D. R., Kurts, C. Dendritic Cells and Macrophages: Sentinels in the Kidney. Clin. J. Am. Soc. Nephrol. , (2015).
- Williams, S. K., McKenney, S., Jarrell, B. E. Collagenase lot selection and purification for adipose tissue digestion. Cell Transplant. 4 (3), 281-289 (1995).
- Yamamoto, T., et al. Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation. Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).
- Zhou, J., Nagarkatti, P., Zhong, Y., Nagarkatti, M. Immune modulation by chondroitin sulfate and its degraded disaccharide product in the development of an experimental model of multiple sclerosis. J. Neuroimmunol. 223 (1-2), 55-64 (2010).
