This protocol describes how to determine whether pharmacological treatments for experimental autoimmune encephalomyelitis show CNS protection as a consequence of suppressing immune cell infiltration or are neuroprotective during the onslaught of immune cell infiltration.
A major hallmark of the autoimmune demyelinating disease multiple sclerosis (MS) is immune cell infiltration into the brain and spinal cord resulting in myelin destruction, which not only slows conduction of nerve impulses, but causes axonal injury resulting in motor and cognitive decline. Current treatments for MS focus on attenuating immune cell infiltration into the central nervous system (CNS). These treatments decrease the number of relapses, improving quality of life, but do not completely eliminate relapses so long-term disability is not improved. Therefore, therapeutic agents that protect the CNS are warranted. In both animal models as well as human patients with MS, T cell entry into the CNS is generally considered the initiating inflammatory event. In order to assess if a drug protects the CNS, any potential effects on immune cell infiltration or proliferation in the periphery must be ruled out. This protocol describes how to determine whether CNS protection observed after drug intervention is a consequence of attenuating CNS-infiltrating immune cells or blocking death of CNS cells during inflammatory insults. The ability to examine MS treatments that are protective to the CNS during inflammatory insults is highly critical for the advancement of therapeutic strategies since current treatments reduce, but do not completely eliminate, relapses (i.e., immune cell infiltration), leaving the CNS vulnerable to degeneration.
다발성 경화증 (MS)는 주로 초기에 질병에있는 뇌의 백질 지역에서 염증성 병변을 특징으로한다. 장기간의 진행 후, 회백질 위축은 MRI 영상 검출 및 신경 퇴행성 질환의 위상을 표시한다. 반응성 신경교 증, 탈수 초화 및 백질의 축삭 손상은 CNS-침투 면역 세포에 기인한다. 현재 CNS의 신경 퇴행을 예방 직접 역방향 또는 MS에서 사용되는 치료 없음 – 대신, CNS로 T 세포 활성화 및 / 또는 침투를 감쇠하여 염증을 감소하지 않는다. 이 MS에 대한 치료는없고 현재 치료를 사용하여 환자가 질병의 진행을 계속 발생하기 때문에, 탈수 초화 및 신경 세포 손실을 방지 약물의 발견은 매우 중요하다. 즉, CNS에 감소 손상이 – -의 S 보이는 그러나, 면역 세포에 작용 및 CNS에 그 구별하는 결과로, 실험적으로 어려울 수 있습니다에 관계없이 발생되는 메커니즘의 AME. 따라서, CNS 보호의 평가는 질병 메커니즘에 미치는 영향 약리 에이전트를 결정하기 위해 주변에 면역 세포와 면역 세포의 증식을 CNS는-침투의 평가와 협력해야합니다.
실험자가 면역 뇌척수염 (EAE)은 현재 MS 1-4 치료 용 약물의 발견에 대한 직접 책임 염증성자가 면역 질환의 잘 확립 된 동물 모델이다. 마우스는 종종 C57BL / 6 마우스는 유전자 변이체의 가용성에 따라 인기 균주 인 상태 EAE 사용된다. EAE로 유도 C57BL / 6 마우스는 10 일 후 유도 주위에 발병 만성 질병의 진행을 나타낸다. 척수 실질 및 소뇌 피질 침투 실질 5 침윤의 유무,이 동물의 조직 병리학 적 특성이다. ㄴ에서 또한 대뇌 피질의 병변 및 탈수 초화비는 C57BL / 6 마우스에서 상대적으로 결석 질환 6-9의 특징이다. 재발 완화 성 질환 및 MS (10)에서 나타나는 것과 유사한 뇌와 척수 모두에서 발견되는 병소가 SJL 마우스를 사용할 때 가능 따라서 바람직하다.
면역 세포는 CNS에 도달하지 않을 경우, 치료는 신경 세포로 분류 될 수 없다. 따라서,이 프로토콜은 이전에 11 있듯이 뇌, 척수 및 EAE 마우스에서 비장의 유세포 분석의 사용은, 면역 세포 상기 CNS에 침입하여 주변의 면역 세포의 증식에 대한 치료 효과를 확인 할 수있다. 범위와 신경의 성격을 결정하는 CNS 조직의 면역 조직 화학적 분석도 설명한다. 이들 방법을 조합하면 CNS 였는지 PR 면역 세포가 활성화 된 면역 세포가 CNS 입력 여부를 주변에 확산되었는지 여부의 판정이 가능하고,염증이나 손상 otected. 신경 보호 효과가 면역 체계에 영향에도 불구하고 의심되는 경우, 실험자는 CNS가 발생한으로 치료가 면역 세포의 침윤 후 시작 시간을 변경할 수 있습니다.
여기서는 활성 EAE, MS의 T 세포 매개 된 동물 모델의 서로 다른 모델들을 사용하는 프로토콜을 제공하고, 다른 측면에 실험 요법의 효능을 결정하는 질병 중 다양한 시간 점에서 면역 조직 화학 결합 분석 유동 세포 계측법 MS의 발병 기전. 이 방법은 면역 세포 증식 및 CNS 보호 대 침투에 영향을 구별 약물이 질병의 발병 기전에 작용하는 방법을 쉽게 좁힐 만드는 연구를 도움이 될 것입니다.
MS 환자는 CNS로 T 세포 활성화 및 / 또는 침투를 감쇠 약물 복용 직접 CNS 보호 치료법의 개발을 정당화하는 동안 질병의 재발을 경험하는 것을 계속한다. EAE는 고전 MS의 현상을 모델링하기 위해 사용되었고, 생체 내에서의 면역 시스템 및 CNS의 상호 작용의 특성을 연구 할 때 강력한 도구가 될 수있다. 주변부에서 면역 세포 상기 CNS의 침투 및 확산 및 활성화를 검사와 함께 전 또는 질병의 개시 후 치료 EAE의 고려, 예를 들어, 타이밍을 사용하여, 면역 체계 모두에서 치료 효과를 서술 할 수있다 중추 신경계.
C57BL / 6 마우스에 EAE이 널리 이용되고 있지만 이러한 마우스는 실질의 재발 송금 표현형 및 면역 세포의 침윤이 같이 SJL 마우스에 EAE는 MS의 대부분의 경우 더 많은 대표 될 수있다뇌 10. SJL 마우스는 질병이 제시 한 후에는 가능한 치료를 시작하고 있지만 감소 염증의 시간 동안,뿐만 아니라 사함을하는 동안 분명 복구가 있습니다. SJL 마우스는 항상 재발 및 결과를 풀링 할 때 잠재적으로 큰 변화의 결과로, 동시성에 송금하지 않도록 고려하는 것이 중요합니다. 따라서 일부 연구자들은 질병의 진행에 개별 지점에서 FACS 분석 및 조직학을 위해 마우스를 복용하는 동안 한 동물에서 임상 점수에 대한 대표적인 결과를 표시하도록 선택할 수 있습니다.
조작이 치료는 면역 시스템 또는 중추 신경계에 영향을 미치는 방법의 결정에 도움을 줄 수 EAE 마우스에 대한 때 고려. 처리가 시작되면 많은 옵션 자체의 면역 세포가 CNS에 진입했는지에 대한 내포 방법 각각은은 CNS와 상호 작용 될 수있다. 증상의 발병하기 전에 치료는 면역 세포가 아직 입력 또는 중추 신경계에 손상을 발생하지 않은 것을 의미한다.증상의 발병 후 치료는 면역 세포가 중추 신경계를 입력 한 일부 손상의 원인이 있다는 것을 의미한다. SJL 마우스를 사용, 치료는 면역 세포가 활발하게 침투 및 염증을 유발하거나 면역 세포가 적은 염증으로 CNS에 널리 보급 될 수 사함, 동안되는 재발 동안 시작할 수 있습니다. 면역 세포 치료시 병적 과정에서 어디 고려할 때 치료법은 CNS 및 면역계에 미치는 영향에 관한 초기 가정이 이루어질 수있다.
치료는 면역 세포 및 CNS, EAE 증상의 중증도를 감소시키는 최종 결과 각각 영향을 미칠 수있는 여러 가지 방법이있다. 그러므로, 면역 세포가 CNS 입력 여부 외주와 CNS에 영향을 받는지 면역 세포 보는 유세포 분석 및 면역 조직 화학 법을 사용하는 것이 필요하며, 중추 신경계 치료에 반응하는 방법. 척수의 유세포 분석은 얼마나 많은 셀 HA를 결정할 수 있지만주어진 시간에 CNS를 입력했습니다, 하나는 면역 세포의 증식이 비장에 영향을받지 않는 한이 효과가 감소 된 면역 세포 인신 매매에 의한 것을 확인할 수 없습니다. 이는 말초 및 CNS 조직을 분석하여 양쪽 조직을 비교할 때 기계적으로 의미하는 결과를 결정하는 것이 필요하다. 면역 세포 활성 프로파일이 조절 T 세포 무거운 프로필 병원성 헬퍼 T 세포 무거운 프로필 스위치를 갖는, 예를 들면, 처리에 의해 변경되는 것이 또한 가능하다. 다른 세포 유형의 마커를 찾고 치료 및 치료 동물 사이 %의 발현을 비교하는 따라서도 중요한 고려 사항이다. MS 연구 신흥 개념은 B 세포가자가 면역 탈수 초에서 중요한 역할을한다는 것을 암시한다. 이것은 B 세포는 T 세포 (20)의 활성화에 필요한 것을 보여주는 연구에 기초한다. 이 개념은 예 리툭시 맵, CD20의 예에 대한 항체와 같은 치료의 성공에 의해지지된다B 세포 (21, 22)의 표면에 가압. 임상 시험에 모노클로 날 항체 ocrelizumab의 성공에 의해 입증 된 바와 같이, CD20의 다른 에피토프를 표적 약물은 B 세포 치료제 타겟 (23)의 효과를 향상시킬 수있다.
여기에 제시된 기술의 한 가지 제한은 면역 세포가 CNS를 입력하지만 실질 여행 할 수 없게하는 것이 가능하다는 것이다. 면역 취급과 미처리 동물 사이에서 실질 이동 거리를 면역 세포의 혈관 주위있는 절삭을 검출하고 평가하기 위해 사용될 수있다. 또 다른 잠재적 인 한계가 EAE 병인의 마이크로 바이의 효과를 포함한다. 공생 장내 미생물은 크게 질병 발병 (24)에 영향을 미칠 수있다; 따라서, 마우스는 다른 식민지에 보관, 심지어 다른 우리에서 질환의 중증도에 광대 한 차이가있을 수 있습니다. 동일한 케이스에서 발생 한배 새끼 컨트롤을 사용 가능한 따라서, 항상 바람직EAE를 포함하는 실험. 마지막 주는 주변의 면역 세포 증식의 변화의 영향을 제거하기 위해 실험적으로 바람직한 경우, 패시브 전사 유도하기보다는,이 프로토콜에 기재된 활성 유도를 이용하여이를 수행 할 수있을 수 있다는 것이다.
신경에 대한 확인은 또한 세포 사멸 또는 선택적 세포 유형에 단백질의 결실을 허용 조건부 녹아웃 마우스의 사용을 통해 특정 메커니즘을 테스트하기 위해 공존 배양 시스템 (11)을 사용하여 달성 될 수있다. 또한, 신경 있습니다 약리 에이전트의 탐사를 확장, 축삭 절개 및 신경 세포의 죽음의 표식이 포함되어야한다. 중요성의 또 다른 영역은 재유 수화입니다. 부상 축삭은 신경 치료가 재유 수화 치료의 중요한 부분이되어야 추가 지원 대출 remyelinate 할 수 없습니다. 또한, 수초 축삭은 myelina보다 부상에 더 취약테드의 축삭. 이것은 축삭이 축삭 손상을 방지 할 적절한 재유 수화를 촉진 탈수 초 치료 적 개입이되면 제안합니다. 이 도로를 탐색하려면, 탈수 초화 및 재유 수화 다른 생체 내 모델 (즉, cuprizone 및 리소 레시틴)을 사용할 수있다. 이 방법은 본원에서 미엘린 손실을 정량함으로써 신경 평가에 초점을 설명한다. 재유 수화 평가 선조 세포의 수뿐만 아니라, 증식과 같은 조사하는 것이 중요 할 것이다 성숙 그들의 능력. 이러한 대안 모델의 언급으로, 사람은 급속도로 매개되는 뇌염의 다른 모델을 고려해야합니다. 미엘린 손실을 생성 두 잘 특성화 RNA 바이러스 모델이있다 : 하나는 Theiler의 쥐 뇌척수염 비 포위 Picornaviridae 바이러스이고, 다른 하나는 마우스 간염 바이러스의 Coronaviridae 바이러스 군 (25, 26)의 일원이다.
EAE는 일을위한 유용한 도구입니다조작 또는 치료가 면역 체계와 생체 내에서 중추 신경계에 영향을 미치는 방법의 udies. 치료는 질병 과정에 영향을 미치는 곳은 혈액 – 뇌 장벽에서 또는 CNS에서 주위에 있는지 여부를 결정하는 데 도움 여기에 설명 된 프로토콜. MS에 대한 현재의 치료는 질환 및 환자의 시간에 종종 경험 하락을 치료하지 않습니다. 마찬가지로, 급성 파종 성 뇌척수염, 횡단 성 척수염 및 시신경 척수염,이 면역 세포에 침투하여 공격 바로 아래로 CNS를 보호 부족 치료를 포함하는 면역 세포의 중추 신경계에 침투와 수초의 분해를 포함하는 다른 질병. 고려 처리의 타이밍을 촬영 및 치료에 대하여 이루어져야 기계적 결정을 허용한다 염증 손상을 평가하기 위해 CNS의 면역과 관련하여 유세포 분석 비장 및 척수를 사용.
The authors have nothing to disclose.
일반 기금 기금, 국가 -이 작품은, 국립 다발성 경화증 SocietyRG 4587-A-1 Civitan 국제 학술 진흥 재단, 마이크 L. Jezdimir 횡단 성 척수염 재단, 알라바마 보건 서비스 재단의 대학 NINDS P30-NS069324에 의해 투자되었다 국립 알레르기 연구소 감염증, 건강의 국립 연구소에서 과학 재단 1,355,183 및 T32 AI007051.
22 x 22 x 20 mm embedding mold | Fisher Scientific | NC9719245 | |
22 x 30 x 20 mm embedding mold | Fisher Scientific | NC9531194 | |
2-Mercaptoethanol (55mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
2-Methylbutane | Fisher Scientific | O3551-4 | |
30 x 22 x 20 mm embedding mold | Fisher Scientific | 18-30 | |
ACK Lysing Buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
anti-CD4 PE-Cy7 | BD Biosciences | 552775 | 0.2 mg/mL stock concentration |
anti-Foxp3-FITC | eBioscience | 11-5773-82 | 0.5 mg/mL stock concentration |
anti-GFAP (Cocktail) | Biolegend | 835301 | 1-3 mg/mL stock concentration |
anti-Iba-1 Polyclonal Antibody (50 ug) | Wako | 019-19741 | 0.5 mg/mL stock concentration |
anti-IFN-γ APC | eBioscience | 17-7311-82 | 0.2 mg/mL stock concentration |
anti-IL-17A PerCP-Cy5.5 | eBioscience | 45-7177-82 | 0.2 mg/mL stock concentration |
anti-Ki-67 PE | eBioscience | 12-5698-82 | 0.2 mg/mL stock concentration |
anti-MBP (D-18) | Santa Cruz Biotechnology | sc-13912 | 0.2 mg/mL stock concentration |
anti-TCRβ FITC | eBioscience | 11-5961-85 | 0.5 mg/mL stock concentration |
anti-TCRβ PE | eBioscience | 12-5961-83 | 0.2 mg/mL stock concentration |
Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG | Vector Labs | BA-1000 | 1.5 mg/mL stock concentration |
Biotinylated Horse Anti-Mouse IgG | Vector Labs | BA-2000 | 1.5 mg/mL stock concentration |
Citric Acid, Anhydrous, 99.5% | Fisher Scientific | AC42356-5000 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), tetrasodium salt dihydrate, 99% | Fisher Scientific | AC446085000 | |
Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, case of 10 | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set | eBioscience | 00-5523-00 | Foxp3 transcription factor staining reagents |
Golgi Plug | BD Biosciences | 555029 | protein transport inhibitor |
Immedge Hydrophobic Barrier Pen | Fisher Scientific | NC9545623 | |
Ionomycin | EMD Millipore | 407952-5mg | |
L-Glutamine, 100X | Corning | 25-005-Cl | |
MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-Cl | |
Near IR Live/Dead Staining Kit | Life Technologies | L10119 | viability dye |
Normal goat serum | Vector Labs | S-1000 | |
Normal horse serum | Vector Labs | S-2000 | |
Paraformaldehyde, 96% | Fisher Scientific | AC416785000 | |
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X | Corning | 30-002-Cl | |
Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | density gradient |
Permount | Fisher Scientific | SP15-500 | resinous mounting medium |
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma | P1585-1mg | |
Purified anti-Myelin Basic Protein Antibody | BioLegend | 808401 | |
RPMI 1640 | Corning | 10-040-CM | |
Sodium Pyruvate | Corning | 25-000-Cl | |
Tissue-Tek CRYO-OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | nonionic detergent |
Vectastain Elite ABC Kit (Standard) | Fisher Scientific | NC9206402 | avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase |
Vector Laboratories Peroxidase Substrate Kit (DAB) | Fisher Scientific | NC9276270 | DAB solution |