This protocol describes how to determine whether pharmacological treatments for experimental autoimmune encephalomyelitis show CNS protection as a consequence of suppressing immune cell infiltration or are neuroprotective during the onslaught of immune cell infiltration.
A major hallmark of the autoimmune demyelinating disease multiple sclerosis (MS) is immune cell infiltration into the brain and spinal cord resulting in myelin destruction, which not only slows conduction of nerve impulses, but causes axonal injury resulting in motor and cognitive decline. Current treatments for MS focus on attenuating immune cell infiltration into the central nervous system (CNS). These treatments decrease the number of relapses, improving quality of life, but do not completely eliminate relapses so long-term disability is not improved. Therefore, therapeutic agents that protect the CNS are warranted. In both animal models as well as human patients with MS, T cell entry into the CNS is generally considered the initiating inflammatory event. In order to assess if a drug protects the CNS, any potential effects on immune cell infiltration or proliferation in the periphery must be ruled out. This protocol describes how to determine whether CNS protection observed after drug intervention is a consequence of attenuating CNS-infiltrating immune cells or blocking death of CNS cells during inflammatory insults. The ability to examine MS treatments that are protective to the CNS during inflammatory insults is highly critical for the advancement of therapeutic strategies since current treatments reduce, but do not completely eliminate, relapses (i.e., immune cell infiltration), leaving the CNS vulnerable to degeneration.
La sclerosi multipla (SM) è caratterizzata da lesioni infiammatorie prevalentemente nelle regioni sostanza bianca del cervello nelle prime fasi della malattia. Dopo progressione a lungo termine, sostanza grigia atrofia viene rilevata mediante imaging MRI e segna la fase neurodegenerativa della malattia. gliosi reattiva, demielinizzazione, e danno assonale nella sostanza bianca sono attribuiti a CNS-infiltranti cellule immunitarie. Nessuno dei trattamenti attualmente utilizzati in MS inversa o direttamente prevenire la neurodegenerazione nel SNC – invece, ridurre l'infiammazione attenuando l'attivazione delle cellule T e / o infiltrazione nel SNC. Poiché non esiste una cura per la SM e pazienti che utilizzano trattamenti attuali continuano a sperimentare la progressione della malattia, le scoperte di farmaci che impediscono la demielinizzazione e perdita neuronale sono di fondamentale importanza. Tuttavia, distinguendo tra effetti sulle cellule immunitarie e quelli sul sistema nervoso centrale, può essere difficile sperimentalmente, come risultato – cioè, ridotta danni al SNC – guarda le same indipendentemente dei meccanismi attraverso i quali si verifica. Pertanto, la valutazione di protezione del sistema nervoso centrale deve essere una partnership con le valutazioni di SNC-infiltrazione di cellule immunitarie e la proliferazione delle cellule immunitarie nella periferia di determinare come agenti farmacologici influisce meccanismi di malattia.
Encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è un modello animale consolidata di malattie infiammatorie autoimmuni che era direttamente responsabile per la scoperta di farmaci attualmente utilizzati per il trattamento di MS 1-4. I topi sono spesso utilizzati per EAE, con C57BL / 6 topi essere un ceppo popolare basata sulla disponibilità di varianti genetiche. C57BL / 6 topi indotti con EAE mostrano progressione della malattia cronica, con insorgenza intorno al giorno 10 post-induzione. L'infiltrazione del parenchima del midollo spinale e del cervelletto sono caratteristici della istopatologia di questi animali, con l'assenza di infiltrazione nel parenchima corticale 5. lesioni Inoltre, corticali e demielinizzazione nel bpioggia sono caratteristiche della malattia 6-9, che sono relativamente assenti in C57BL / 6 topi. Pertanto, può essere preferibile quando possibile utilizzare topi SJL, che hanno la malattia recidivante-remittente e lesioni riscontrate sia nel cervello e il midollo spinale che sembrano simili a quelle di MS 10.
Il trattamento non può essere classificato come neuroprotettivo se le cellule immunitarie non raggiungono mai il sistema nervoso centrale. Pertanto, questo protocollo fa uso di flusso citometria di cervello, midollo spinale, e milza di topi EAE determinare effetti del trattamento sulla infiltrazione di cellule immunitarie nel sistema nervoso centrale e la proliferazione delle cellule immunitarie nella periferia, come precedentemente dimostrato 11. analisi immunoistochimica del tessuto del sistema nervoso centrale per determinare entità e la natura di neuroprotezione è anche descritto. La combinazione di questi metodi consente di determinare se le cellule immunitarie sono stati attivati e proliferano in periferia, se le cellule immunitarie entrati nel CNS, e se il CNS era protected da infiammazione o danni. Se gli effetti neuroprotettivi sono sospettate nonostante effetti sul sistema immunitario, sperimentatori possono alterare trattamento orari di inizio dopo l'infiltrazione di cellule immunitarie nel è verificato il CNS.
Qui, vi presentiamo un protocollo utilizzando due diversi modelli di EAE attivo, un modello animale cellulo-mediata T della sclerosi multipla, e citometria a flusso analisi combinata con immunoistochimica in diversi punti temporali durante la malattia per determinare l'efficacia delle terapie sperimentali su diversi aspetti della patogenesi della SM. Questo metodo aiuterà i ricercatori a distinguere tra effetti sulla proliferazione delle cellule immunitarie e l'infiltrazione contro la protezione del sistema nervoso centrale, rendendo più facile per restringere come farmaci agiscono sulla patogenesi della malattia.
I pazienti con SM continuano a sperimentare le recidive di malattia durante l'assunzione di farmaci che attenuano l'attivazione delle cellule T e / o infiltrazione nel sistema nervoso centrale, garantendo lo sviluppo di opzioni di trattamento che proteggono direttamente il sistema nervoso centrale. EAE è stato classicamente utilizzato per modellare i sintomi della sclerosi multipla e può essere un potente strumento quando si studia la natura delle interazioni tra il sistema immunitario e del sistema nervoso centrale in vivo. Utilizzando tempi di considerazioni di trattamento in EAE, ad esempio, prima o dopo l'inizio della malattia, in combinazione con l'esame infiltrazione delle cellule immunitarie nel SNC e la proliferazione e l'attivazione in periferia, è possibile delineare gli effetti dei trattamenti sia sul sistema immunitario e il CNS.
Mentre EAE nel topo C57BL / 6 è più ampiamente utilizzato, EAE nel SJL mouse potrebbe essere più rappresentativi della maggior parte dei casi di SM, come questi topi hanno un fenotipo dirimessa e infiltrazione di cellule immunitarie nel parenchimadel cervello 10. topi SJL hanno recupero chiara durante la remissione pure, rendendo possibile iniziare il trattamento dopo che la malattia ha presentato, ma durante i periodi di riduzione dell'infiammazione. E 'importante considerare che i topi SJL non sempre ricaduta e rimettono in sincronia, con conseguente potenzialmente grande variabilità quando i risultati vengono raggruppati. Di conseguenza, alcuni ricercatori possono scegliere di mostrare i risultati rappresentativi per i punteggi clinici da un animale durante l'assunzione di topi per l'analisi FACS ed istologia a punti individualizzati nella progressione della malattia.
Considerando quando manipolazioni sono fatti per topi EAE può aiutare nella determinazione di come un trattamento agisce sul sistema immunitario o CNS. Ci sono molte opzioni per quando inizia il trattamento, ciascuno con la propria connotazione di se le cellule immunitarie sono entrati nel sistema nervoso centrale e come essi possono essere che interagiscono con il sistema nervoso centrale. Trattamento prima comparsa dei sintomi implica che le cellule immunitarie non sono ancora entrate o causato danni al sistema nervoso centrale.Trattamento dalla comparsa dei sintomi suggerisce che le cellule immunitarie sono entrati nel sistema nervoso centrale e hanno causato qualche danno. Utilizzando topi SJL, il trattamento può anche iniziare durante una ricaduta, in cui le cellule immunitarie sono attivamente infiltrando e causando infiammazione, o durante la remissione, in cui le cellule immunitarie possono essere meno diffuso nel SNC con meno infiammazione. ipotesi iniziali per quanto riguarda come trattamenti colpiscono il sistema nervoso centrale e il sistema immunitario può essere fatto se si considera dove le cellule immunitarie sono nel processo patologico durante il trattamento.
Ci sono un certo numero di modi in cui i trattamenti possono influire cellule immunitarie e del SNC, ciascuno con il risultato finale di ridurre la gravità dei sintomi EAE. Pertanto, è necessario utilizzare l'analisi citofluorimetrica e immunoistochimica guardare a come le cellule immunitarie sono influenzate in periferia e CNS, se le cellule immunitarie sono entrati nel CNS, e come il CNS reagisce al trattamento. Mentre l'analisi di citometria di flusso del midollo spinale in grado di determinare quante cellule ettarive entrato nel CNS in un determinato momento, non si può determinare che questo effetto è dovuto al ridotto il traffico delle cellule immunitarie meno proliferazione delle cellule immunitarie è influenzato nella milza. È pertanto necessario analizzare sia tessuti periferici e CNS e determinare quali risultati medi meccanicamente quando entrambi i tessuti vengono confrontati. E 'anche possibile per profili di attività delle cellule immunitarie che deve essere modificato mediante trattamento, per esempio avendo un interruttore in un profilo patogeno cellule helper T pesanti ad un profilo cella pesante T normativo. Guardando i marcatori per i diversi tipi di cellule e confrontando espressione per cento tra gli animali trattati e non trattati è quindi anche una considerazione importante. Un concetto emergente nella ricerca MS suggerisce che le cellule B svolgono un ruolo importante nella demielinizzazione autoimmune. Questo si basa su studi che dimostrano che le cellule B sono necessarie per la riattivazione di cellule T 20. Questo concetto è supportato dal successo di trattamenti come rituximab, un anticorpo contro CD20 expremuto sulla superficie delle cellule B 21,22. Come dimostrato dal successo del ocrelizumab anticorpo monoclonale in studi clinici, farmaci destinati differenti epitopi di CD20 può migliorare l'efficacia delle cellule B mirati terapeutica 23.
Una limitazione delle tecniche presentate qui è che è possibile per le cellule immunitarie di entrare nel CNS ma essere in grado di viaggiare nel parenchima. Immunoistochimica può essere utilizzato per rilevare manicotti perivascolari di cellule immunitarie e valutare distanza percorsa nel parenchima tra gli animali trattati e non trattati. Un altro potenziale limitazione riguarda gli effetti della microbiome sulla EAE patogenesi. Commensale flora intestinale può influenzare pesantemente patogenesi della malattia 24; di conseguenza, i topi alloggiati in diverse colonie e anche in diverse gabbie possono avere grandi differenze nella gravità della malattia. Di conseguenza, è sempre preferibile ove possibile utilizzare i controlli littermate sollevati nella stessa gabbia peresperimenti EAE. Una nota finale è che se è sperimentalmente desiderabile eliminare gli effetti delle cellule immunitarie cambiamenti proliferative della periferia, può essere possibile farlo utilizzando induzione trasferimento passivo piuttosto che l'induzione attivo descritto in questo protocollo.
Un'ulteriore conferma per la neuroprotezione può essere realizzato utilizzando un sistema di co-coltura 11 per testare specifici meccanismi di morte cellulare o tramite l'utilizzo di topi knockout condizionali che consente l'eliminazione di proteine selettivamente su un tipo di cellula. Inoltre, per estendere l'esplorazione di agenti farmacologici che sono neuroprotettivo, marcatori di transezione assonale e morte neuronale dovrebbero essere inclusi. Un altro settore di importanza è rimielinizzazione. assoni feriti sono in grado di remyelinate prestare ulteriore sostegno che le terapie neuroprotettive dovrebbe essere una parte importante di terapie rimielinizzazione. Inoltre, gli assoni amieliniche sono più vulnerabili al danno di myelinaassoni TED. Questo suggerisce che quando un assone diventa interventi terapeutici demielinizzati che promuovono la rimielinizzazione tempestivo impedirà danno assonale. Per esplorare queste vie, altri modelli in vivo per la demielinizzazione e rimielinizzazione possono essere utilizzati (ad esempio, cuprizone e lisolecitina). Il metodo descritto nel presente documento si è concentrato sulla valutazione neuroprotezione quantificando la perdita di mielina. Per la valutazione della remyelination il numero di cellule progenitrici nonché la loro capacità di proliferare e maturare sarebbe anche importante indagare. Con la menzione di questi modelli alternativi, si deve anche considerare diversi modelli di encefalite virale che sono mediate. Ci sono due modelli ben caratterizzati virale di RNA che producono la perdita di mielina: uno è encefalomielite murina di Theiler, un virus senza involucro Picornaviridae, e l'altro è il mouse virus dell'epatite, un membro della famiglia di virus Coronaviridae 25,26.
EAE è uno strumento prezioso per studies di come manipolazioni o trattamenti influenzano il sistema immunitario e del sistema nervoso centrale in vivo. Il protocollo qui descritto può aiutare a determinare se i trattamenti colpiscono il processo della malattia, sia in periferia, alla barriera emato-encefalica, o nel SNC. Nessun attuali trattamenti per la SM curare la malattia e spesso i pazienti esperienza declino nel corso del tempo. Allo stesso modo, altre malattie che coinvolgono l'infiltrazione di cellule immunitarie nel sistema nervoso centrale e la degradazione della mielina, compresa l'encefalomielite acuta disseminata, mielite trasversa, e neuromielite ottica, trattamenti mancanza che proteggono il sistema nervoso centrale in quanto è direttamente sotto attacco da infiltrazione di cellule immunitarie. Prendendo in considerazione i tempi di trattamento e mediante analisi citofluorimetrica della milza e del midollo spinale in combinazione con immunoistochimica del SNC per valutare l'infiammazione e danni consentirà determinazioni meccanicistici essere fatte riguardo trattamenti.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato finanziato dal NINDS P30-NS069324, la National Multiple Sclerosis SocietyRG 4587-A-1, la Fondazione Civitan International Research, The Mike L. Jezdimir trasversa Mielite Foundation, The University of Alabama Servizi sanitari Fondazione – Generale Endowment Fund, The National Science Foundation 1355183, e T32 AI007051 dal National Institute of Allergy e Malattie infettive, National Institutes of Health.
22 x 22 x 20 mm embedding mold | Fisher Scientific | NC9719245 | |
22 x 30 x 20 mm embedding mold | Fisher Scientific | NC9531194 | |
2-Mercaptoethanol (55mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
2-Methylbutane | Fisher Scientific | O3551-4 | |
30 x 22 x 20 mm embedding mold | Fisher Scientific | 18-30 | |
ACK Lysing Buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
anti-CD4 PE-Cy7 | BD Biosciences | 552775 | 0.2 mg/mL stock concentration |
anti-Foxp3-FITC | eBioscience | 11-5773-82 | 0.5 mg/mL stock concentration |
anti-GFAP (Cocktail) | Biolegend | 835301 | 1-3 mg/mL stock concentration |
anti-Iba-1 Polyclonal Antibody (50 ug) | Wako | 019-19741 | 0.5 mg/mL stock concentration |
anti-IFN-γ APC | eBioscience | 17-7311-82 | 0.2 mg/mL stock concentration |
anti-IL-17A PerCP-Cy5.5 | eBioscience | 45-7177-82 | 0.2 mg/mL stock concentration |
anti-Ki-67 PE | eBioscience | 12-5698-82 | 0.2 mg/mL stock concentration |
anti-MBP (D-18) | Santa Cruz Biotechnology | sc-13912 | 0.2 mg/mL stock concentration |
anti-TCRβ FITC | eBioscience | 11-5961-85 | 0.5 mg/mL stock concentration |
anti-TCRβ PE | eBioscience | 12-5961-83 | 0.2 mg/mL stock concentration |
Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG | Vector Labs | BA-1000 | 1.5 mg/mL stock concentration |
Biotinylated Horse Anti-Mouse IgG | Vector Labs | BA-2000 | 1.5 mg/mL stock concentration |
Citric Acid, Anhydrous, 99.5% | Fisher Scientific | AC42356-5000 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), tetrasodium salt dihydrate, 99% | Fisher Scientific | AC446085000 | |
Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, case of 10 | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set | eBioscience | 00-5523-00 | Foxp3 transcription factor staining reagents |
Golgi Plug | BD Biosciences | 555029 | protein transport inhibitor |
Immedge Hydrophobic Barrier Pen | Fisher Scientific | NC9545623 | |
Ionomycin | EMD Millipore | 407952-5mg | |
L-Glutamine, 100X | Corning | 25-005-Cl | |
MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-Cl | |
Near IR Live/Dead Staining Kit | Life Technologies | L10119 | viability dye |
Normal goat serum | Vector Labs | S-1000 | |
Normal horse serum | Vector Labs | S-2000 | |
Paraformaldehyde, 96% | Fisher Scientific | AC416785000 | |
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X | Corning | 30-002-Cl | |
Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | density gradient |
Permount | Fisher Scientific | SP15-500 | resinous mounting medium |
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma | P1585-1mg | |
Purified anti-Myelin Basic Protein Antibody | BioLegend | 808401 | |
RPMI 1640 | Corning | 10-040-CM | |
Sodium Pyruvate | Corning | 25-000-Cl | |
Tissue-Tek CRYO-OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | nonionic detergent |
Vectastain Elite ABC Kit (Standard) | Fisher Scientific | NC9206402 | avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase |
Vector Laboratories Peroxidase Substrate Kit (DAB) | Fisher Scientific | NC9276270 | DAB solution |