Dev ünilamellar vesikül (GUV) membranlanna bağlanan, HIV-1 Gag Görselleştirme
Summary
We illustrate here an in vitro membrane binding assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes are visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique.
Abstract
HIV-1, yapısal bir protein, Pr55 Gag (veya Gag) virüs montaj sırasında hücrelerin plazma zarına bağlanmaktadır. Gag bağlayıcı Membran viral parçacık üretimi ciddi bozulmaya Gag membran bağlama sonuçlarında bir kusur beri virüs parçacık oluşumu için önemli bir adımdır. Gag-lipid membran etkileşimlerin mekanik ayrıntıları elde etmek için, in vitro yöntemler, NMR protein ayak izi, yüzey plazmon rezonansı, lipozom flotasyon santrifüj veya floresan lipit boncuk göre, şimdiye kadar geliştirilmiş bağlanma. Bununla birlikte, bu, in vitro yöntemler, her birinin kısıtlamaları vardır. Bu sınırlamaların bazılarının üstesinden gelmek ve daha önce kurulmuş yöntemleri tamamlayıcı bir yaklaşım sağlamak için, biz HIV-1 Gag ve lipid membranların arasındaki etkileşimleri bir "hücre benzeri" bir ortamda gerçekleştiği in vitro testi geliştirdi. Bu testte, Gag lipid zarlar bağlanabilen görsel YFP tagge kullanılarak analiz edilird Gag buğday sentezlenen vitro çeviri sistemi ve bir electroformation tekniği ile hazırlanan GUVs içinde germ-merkezli. Burada arka plan açıklamak ve protokoller tahlil için gerekli miristoillenmiş tam uzunlukta Gag proteinleri ve GUV membranlar elde etmek ve mikroskopi ile bağlayıcı Gag-Şef algılamak için.
Introduction
İnsan bağışıklık yetersizliği virüsü tip 1 (HIV-1), çoğu hücre tiplerinde de toplanır ve plazma membranı (PM) ile ilgili tomurcukları zarflı bir virüstür. HİV-1 virüs parçacıklarının montajı Pr55 GAG (GAG) olarak adlandırılan 55 kDa viral çekirdek proteini ile tahrik edilir. Gag dört ana yapısal alana, yani, matris kapsid nükleokapsid ve P6, ve iki aralayıcı peptit SP1 ve SP2 arasında oluşan bir ön-madde poliprotein olarak sentezlenir. Montaj sırasında, matris (MA) etki montaj sitesine Gag hedeflenmesi sorumludur, kapsid (CA) etki Gag-Gag etkileşimlerini aracılık, nükleokapsid (NC) etki viral genomik RNA acemi ve p6 acemi ev sahibi faktörler yardım plazma membran virüs partikül kesme. Gag aynı zamanda, N-terminal ucunda bir 14-karbonlu yağlı asit ya da miristat parçasının ilave edilmesi ile bir ko-translasyonel modifikasyon maruz kalır.
Gag bağlayıcı Membran m beri viral montaj için temel bir gerekliliktirbağlama zarda arızalı utants virüs parçacıkları üretmek için başarısız olur. çift katlı lipid ve son derece temel bir bölge olarak adlandırılan MA etki alanı içinde temel kalıntıların bir küme (hidrofobik etkileşimler aracılık N-terminal miristat yarımı: Biz ve diğerleri MA etki alanı içinde ikili sinyaller aracılık Gag bağlanmasının o zarı göstermiştir PM 1-4 asidik lipidler ile etkileşime HBr). Polyphosphoinositide 5-fosfataz IV (5ptaseIV), AM-özel bir asidik fosfolipid phosphatidylinositol- hidrolizini katalize eden bir enzim, ektopik ekspresyonu ile Gag-membran etkileşim çalışmalar (4,5) -bisphosphate [PI (4,5) P2] fosfatidilinositol-4-fosfat, hücrelerde Gag-PM localisation PI (4,5) P2 3,5 aracılık ettiğini göstermiştir. Bununla birlikte, in vitro çalışmalar, gag-PI (4,5) P fazla mekanik detayları kavramaya yönelik 2 etkileşimlerinin bir takım nedenlerden için zor olduğu kanıtlanmıştır. İçinÖrnek biyokimyasal deneyler için tam boyda saflaştırılması miristoillenmiş HIV-1 Gag bağlı saflaştırma sırasında agregasyon GAG eğilimi en azından kısmen, teknik olarak zor olmuştur. Dolayısıyla, bu tür Myr-MA ya Myr-MS-CA, ya da olmayan miristoillenmiş form olarak, HIV-1 Gag kesilmiş biçimleri sık sık, Gag saflaştırmayı gerektirmektedir çalışmalarda kullanılmıştır (örneğin, nükleer manyetik rezonans, bir protein ayak izi ve yüzey plazmon rezonans 6-9). Seçenek olarak ise, in vitro transkripsiyon için reaksiyonlarda bağlanmış diğer biyokimyasal çalışmalar 1,2 tam uzunluktaki miristoillenmiş HIV-1 Gag üretilmesi için kullanılmıştır. Tipik haliyle, bu sistemde, bir GAG kodlayan plazmid transkripsiyonu ve herhangi bir hücresel membranlar ve haberci RNA yoksun transkripsiyon ve çeviri için makine içeren ökaryotik hücre lizatları (örneğin, tavşan retikülosit lizatları) ile çevrilmiştir. Tepkimeden sonra, Gag içeren hücre lizatları bana karıştırılırlipidler ile Gag etkileşimlerin analizine mbranes. Gag miristoillenmiş tam uzunluktaki hazırlama kolaylığı ile birlikte, in vitro transkripsiyon için sistemi kullanan yöntemler Gag sentezi ve takip eden membran bağlanma reaksiyonları daha fizyolojik koşulları temsil edebilir bir "ökaryotik sitosol benzeri 'ortamda meydana gelen bir avantaja sahiptir. Bu özellik MA etki bağlı RNA molekülleri Gag rekabetçi bir şekilde 1,2,10-12 asidik lipidler bağlanmasını düzenleyen olduğunu gösterdi çalışmalara katkıda bulunmuştur. Bu hücre lizatları elde Gag proteinleri toplam miktarı, yüksek değildir Ancak, radyo-etiketli amino asitler protein metabolik etiketleme bunların saptanması için gereklidir.
yöntemine bağlı olarak gag-lipit etkileşimi ölçmek için, membran preparatları çeşitli kullanılmıştır. Bu yöntemlerin her biri kendi güçlü ve sınırlamaları vardır. En NMR bazlı deneyler, kısa asil lipidlerin kullanımını gerektirirsuda çözünen (örneğin, C4 ve C8-PI (4,5) P2) 6,8 olan zincirler. NMR yöntemler geliştirilmektedir hücrelerde bulunan uzun bir asil zincirine sahip lipidler GAG bağlanma test ederken, şu ana kadar 8,13 yalnızca miristoillenmiş veya nonmyristoylated MA kullanılmıştır. Seçenek olarak ise, yerel uzunlukta açil zincirlerine sahiptir lipidlerden hazırlanan lipozomlar, örneğin lipozom yüzdürme veya floresan lipozom boncuk bağlama analizleri 2,3,10,14-16 biyokimyasal yöntemler kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu deneylerde kullanılan lipozomlar, küçük çaplı, ve böylece de bunların membranlar, dik ve pozitif eğriliğe sahiptir. Bunun aksine, HIV-1 ile enfekte olmuş hücrelerde partikül tertibatının erken aşamasında, Gag yaklaşık GAG ölçekte düzlemsel PM, bağlanan ve daha sonra filizlenen sırasında negatif bir eğrilik indükler. Bu nedenle, dik ve pozitif eğrilik ile lipozom membranlar Gag-lipit etkileşimleri çalışmak için ideal bir lipit bilayers olmayabilir. Lipozom flot gelinceation deneyleri, başka potansiyel ihtar deneysel sonucunu etkileyebilecek santrifüj sırasında hipertonik sakaroz degrade Gag-lipit komplekslerinin olduğu maruz kalmasıdır. Bu sınırlamaları azaltmak ve tamamlayıcı bir deneysel sistem sağlamak için, Gag dev tek lamelli vesiküller (GUVs) bağlanma için deneyler, son yıllarda geliştirilmiştir. GUVs çapları onlarca mikrometre büyüklüğünde uzanır, tek iki tabakalı vesiküllerin husule bulunmaktadır. Böylece, bu membranların eğrilik Gag ölçeğinde PM benzer. Üstelik, optik mikroskoplar altında görsel denetim sağlayan büyük boyutu, membran kolayca Gag-lipit komplekslerinin sonraki işlem olmadan tespit edilebilir karıştırma üzerine bu veziküller floresan etiketli veya etiketli Gag bağlayıcı proteinlerin.
Burada, bir electroformation yöntemiyle elde GUVs kullanarak bağlama, HIV-1 Gag membran incelemek için bir protokol açıklar. Böyle nazik hidrasyon, jel destekli hidrasyon, mikrofon olarak çeşitli yöntemlerrofluidic püskürtme ve electroformation 17-22 GUVs elde edilmesi için kullanılmıştır. Burada tarif edilen protokol için, electroformation yöntemi asidik lipidler ve pahalı düzeneklerinin gerek kalmadan kullanılması da göreli kolaylıkla GUVs oluşturulmasında öncelikle kendi verimliliği kullanılır. GAG görselleştirme bir flüoresan raportör zorunlu kıldığı için, sarı floresan proteini (YFP) genetik GAG (gag-YFP) C-terminaline ilave edilmiştir. Gag-YFP proteinleri sürekli değişimi sürekli akışı (CECF) teknolojisine dayalı buğday tohumu lizatlarında in vitro transkripsiyon ve çeviri reaksiyonları ile elde edilir. Bu teknolojide, tepki ve reaksiyon, substrat ve enerji bileşenlerinin besleme önleyici yan her iki kaldırma, bir diyaliz tabanlı bir mekanizma elde edilir. Bu reaksiyonlar için, bir T7 promoterinin kontrolü altında gag-YFP kodlayan bir plazmid kullanılır. Daha önce gösterildiği gibi notun, buğday tohumu lizatları ek bileşenler 2 olmadan miristoillenmesi destek3,24. Bu yöntemi kullanarak, GUV zarları 24 Gag görselleştirilmesi için gag-YFP miristoillenmiş tam boy yeterli miktarlarda elde etmek mümkün olmuştur. Burada, HIV-1 Gag PI bağlanma hangi bir protokol açıklar (4,5) P2 GUV membranları ihtiva-eden bağlanma reaksiyonları, aşağıdaki ve bu yöntem, bağlanma tahlilleri, önceden var olan gag-membran tamamlar ve olabilir teklif uzun sonradan bir işleme tabi tutulmadan incelenebilir ek bağlanma HIV-1 Gag-membran anlamak için genişletilmiş.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yukarıda açıklandığı gibi GUV bağlama deneyi diğer protein-lipid etkileşim deneyleri kendi sınırlamaları vardır senaryolarda iyi bir alternatif sunuyor. Bu tahlil bize çift katlı lipid bağlamında yerli uzunlukta açil zincirleri ile miristoillenmiş tam uzunlukta Gag ve asidik lipidler arasındaki etkileşimi incelemek ve Gag-lipit yüksek yoğunluklu sakaroz geçişlerini veya diğer post-bağlayıcı işleme yoluyla uzun yüzdürme santrifüj olmadan bunu sağlar kompleksleri. Bir başka avantaj Gag d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz yararlı tartışmalar için Mohammad Saleem, Jing Wu ve Krishnan Raghunathan teşekkür etmek istiyorum. Biz de çekimler sırasında yardım için Priya Begani teşekkür ederiz. Bu eser (AO) R01 AI071727 ve (SLV için) R01 GM110052 Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından hibe desteklenmektedir.
Materials
| Digital Multimeter | Meterman | 30XR | A generic multimeter that can measure resistance and volts will serve the purpose. |
| Function Generator | Instek | GFG-8216A | A generic function generator that is capable of generating a sine wave at 10hz and 1V is sufficient. |
| ITO coated glass slides | Delta Technologies, Loveland, CO | CG-90IN | |
| Incubator | Hoefer | Any incubator that can accurately maintain temperature will be sufficient | |
| Vacuum chamber | Nalgene | ||
| Thermomixer R | Eppendorf | 21516-166 | |
| Syringe | Hamilton | 80400 | Gauge 22S, Syringe number 702 |
| PDMS | Sylgard elastomer base kit, Dow-Corning | Sylgard, 184 | |
| RTS 100 Wheat Germ CECF Kit | BiotechRabbit, Berlin, Germany |
BR1401001 | |
| DiD | Life Technologies, Carlsbad, CA | D7757 | |
| POPC | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL | 850457C | |
| POPS | Avanti Polar Lipids | 840034C | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700041P | |
| Brain-PI(4,5)P2 | Avanti Polar Lipids | 840046X |
References
- Chukkapalli, V., Inlora, J., Todd, G. C., Ono, A. Evidence in support of RNA-mediated inhibition of phosphatidylserine-dependent HIV-1 Gag membrane binding in cells. J Virol. 87 (12), 7155-7159 (2013).
- Chukkapalli, V., Oh, S. J., Ono, A. Opposing mechanisms involving RNA and lipids regulate HIV-1 Gag membrane binding through the highly basic region of the matrix domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (4), 1600-1605 (2010).
- Chukkapalli, V., Hogue, I. B., Boyko, V., Hu, W. S., Ono, A. Interaction between the human immunodeficiency virus type 1 Gag matrix domain and phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate is essential for efficient gag membrane binding. J Virol. 82 (5), 2405-2417 (2008).
- Zhou, W., Parent, L. J., Wills, J. W., Resh, M. D. Identification of a membrane-binding domain within the amino-terminal region of human immunodeficiency virus type 1 Gag protein which interacts with acidic phospholipids. J Virol. 68 (4), 2556-2569 (1994).
- Ono, A., Ablan, S. D., Lockett, S. J., Nagashima, K., Freed, E. O. Phosphatidylinositol (4,5) bisphosphate regulates HIV-1 Gag targeting to the plasma membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (41), 14889-14894 (2004).
- Saad, J. S., et al. Structural basis for targeting HIV-1 Gag proteins to the plasma membrane for virus assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11364-11369 (2006).
- Shkriabai, N., et al. Interactions of HIV-1 Gag with assembly cofactors. Biochemistry. 45 (13), 4077-4083 (2006).
- Vlach, J., Saad, J. S. Trio engagement via plasma membrane phospholipids and the myristoyl moiety governs HIV-1 matrix binding to bilayers. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3525-3530 (2013).
- Anraku, K., et al. Highly sensitive analysis of the interaction between HIV-1 Gag and phosphoinositide derivatives based on surface plasmon resonance. Biochemistry. 49 (25), 5109-5116 (2010).
- Llewellyn, G. N., Grover, J. R., Olety, B., Ono, A. HIV-1 Gag associates with specific uropod-directed microdomains in a manner dependent on its MA highly basic region. J Virol. 87 (11), 6441-6454 (2013).
- Inlora, J., Chukkapalli, V., Derse, D., Ono, A. Gag localization and virus-like particle release mediated by the matrix domain of human T-lymphotropic virus type 1 Gag are less dependent on phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate than those mediated by the matrix domain of HIV-1 Gag. J Virol. 85 (8), 3802-3810 (2011).
- Inlora, J., Collins, D. R., Trubin, M. E., Chung, J. Y., Ono, A. Membrane binding and subcellular localization of retroviral Gag proteins are differentially regulated by MA interactions with phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate and RNA. MBio. 5 (6), e02202 (2014).
- Valentine, K. G., et al. Reverse micelle encapsulation of membrane-anchored proteins for solution NMR studies. Structure. 18 (1), 9-16 (2010).
- Dick, R. A., Goh, S. L., Feigenson, G. W., Vogt, V. M. HIV-1 Gag protein can sense the cholesterol and acyl chain environment in model membranes. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (46), 18761-18766 (2012).
- Dick, R. A., Kamynina, E., Vogt, V. M. Effect of multimerization on membrane association of Rous sarcoma virus and HIV-1 MA proteins. J Virol. 87 (24), 13598-13608 (2013).
- Alfadhli, A., Still, A., Barklis, E. Analysis of human immunodeficiency virus type 1 matrix binding to membranes and nucleic acids. J Virol. 83 (23), 12196-12203 (2009).
- Rodriguez, N., Pincet, F., Cribier, S. Giant vesicles formed by gentle hydration and electroformation: a comparison by fluorescence microscopy. Colloids Surf B Biointerfaces. 42 (2), 125-130 (2005).
- Needham, D., McIntosh, T. J., Evans, E. Thermomechanical and transition properties of dimyristoylphosphatidylcholine/cholesterol bilayers. Biochemistry. 27 (13), 4668-4673 (1988).
- Darszon, A., et al. Reassembly of protein-lipid complexes into large bilayer vesicles: perspectives for membrane reconstitution. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (1), 239-243 (1980).
- Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discuss. Chem. Soc. (81), 303-311 (1986).
- Angelova, M. I., Soléau, S., Méléard, P. h., Faucon, F., Bothorel, P. Preparation of giant vesicles by external AC electric fields. Progr Colloid Polymer Sci. 89, 127-131 (1992).
- Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (12), 4697-4702 (2008).
- Yamauchi, S., et al. The consensus motif for N-myristoylation of plant proteins in a wheat germ cell-free translation system. FEBS J. 277 (17), 3596-3607 (2010).
- Olety, B., Veatch, S. L., Ono, A. Phosphatidylinositol-(4,5)-Bisphosphate Acyl Chains Differentiate Membrane Binding of HIV-1 Gag from That of the Phospholipase Cdelta1 Pleckstrin Homology Domain. J Virol. 89 (15), 7861-7873 (2015).
- Morales-Penningston, N. F., et al. GUV preparation and imaging: minimizing artifacts. Biochim Biophys Acta. 1798 (7), 1324-1332 (2010).
- Veatch, S. L. Electro-formation and fluorescence microscopy of giant vesicles with coexisting liquid phases. Methods Mol Biol. 398, 59-72 (2007).
- Ayuyan, A. G., Cohen, F. S. Lipid peroxides promote large rafts: effects of excitation of probes in fluorescence microscopy and electrochemical reactions during vesicle formation. Biophys J. 91 (6), 2172-2183 (2006).
- Montes, L. R., et al. Electroformation of giant unilamellar vesicles from native membranes and organic lipid mixtures for the study of lipid domains under physiological ionic-strength conditions. Methods Mol Biol. 606, 105-114 (2010).
- Olety, B., Ono, A. Roles played by acidic lipids in HIV-1 Gag membrane binding. Virus Res. 193, 108-115 (2014).
- Keller, H., Krausslich, H. G., Schwille, P. Multimerizable HIV Gag derivative binds to the liquid-disordered phase in model membranes. Cell Microbiol. 15 (2), 237-247 (2013).
- Carlson, L. A., Hurley, J. H. In vitro reconstitution of the ordered assembly of the endosomal sorting complex required for transport at membrane-bound HIV-1 Gag clusters. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (42), 16928-16933 (2012).
- Gui, D., et al. A novel minimal in vitro system for analyzing HIV-1 Gag-mediated budding. J Biol Phys. 41 (2), 135-149 (2015).
- Prevost, C., et al. IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules. Nat Commun. 6, 8529 (2015).
