Visualizzazione del virus HIV-1 gag rilegatura a Giant unilamellari vescicole (GUV) Membrane
Summary
We illustrate here an in vitro membrane binding assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes are visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique.
Abstract
La proteina strutturale del virus HIV-1, Pr55 Gag (o Gag), si lega alla membrana plasmatica in cellule durante il processo di assemblaggio virus. legame di Gag membrana è un passo essenziale per la formazione di particelle di virus, dal momento che un difetto nella membrana Gag risultati vincolanti in grave compromissione della produzione di particelle virali. Per ottenere i dettagli meccanicistici di interazioni di membrana Gag-lipidi, metodi in vitro basati sulla risonanza magnetica nucleare, footprinting proteine, risonanza plasmonica di superficie, liposomi flottazione centrifugazione, o tallone di fluorescenza dei lipidi vincolanti sono stati sviluppati finora. Tuttavia, ciascuno di questi metodi in vitro ha i suoi limiti. Per superare alcune di queste limitazioni e fornire un approccio complementare ai metodi precedentemente stabiliti, abbiamo sviluppato un test in vitro in cui le interazioni tra HIV-1 Gag e membrane lipidiche si svolgono in un ambiente "cell-like". In questo saggio, Gag legame con membrane lipidiche viene analizzato visivamente utilizzando YFP-Tagged Gag sintetizzato in un germe di grano, con sede a sistema di traduzione vitro e GUVs preparati da una tecnica electroformation. Qui si descrive lo sfondo e dei protocolli di ottenere proteine Gag full-length myristoylated e membrane GUV necessarie per il test e di individuare Gag-GUV vincolante al microscopio.
Introduction
dell'immunodeficienza umana di tipo 1 del virus (HIV-1) è un virus con involucro che assembla a gemme e dalla membrana plasmatica (PM) nella maggior parte dei tipi di cellule. L'assemblaggio del virus HIV-1 particelle virali è guidato dal 55 kDa proteina virale chiamata nucleo Pr55 Gag (Gag). Gag è sintetizzato come un precursore poliproteico composta da quattro principali domini strutturali, ovvero matrice, capside, nucleocapside e p6, nonché peptidi due distanziatori SP1 e SP2. Durante il montaggio, la matrice (MA) dominio è responsabile per il targeting di Gag al sito di assemblaggio, il capside (CA) dominio media interazioni-Gag Gag, il nucleocapside (NC) dominio recluta virale di RNA genomici, e fattori dell'ospite p6 reclute che aiuti scissione particella del virus dalla membrana plasmatica. Gag subisce anche una modifica co-traslazionale mediante aggiunta di un acido grasso 14-carbonio o miristato porzione al suo N-terminale.
legame di Gag membrana è un requisito essenziale per l'assemblaggio virale, poiché mutants che sono difettosi in membrana vincolante non riescono a produrre particelle virali. Noi e altri hanno dimostrato che il legame di Gag è mediata da segnali bipartite all'interno del dominio MA membrana: la frazione miristato N-terminale che media interazioni idrofobiche con il doppio strato lipidico e un gruppo di residui di base all'interno del dominio MA definito come regione altamente di base ( HBR) che interagisce con i lipidi acidi sul PM 1-4. Studi di Gag-membrana interazioni con l'espressione ectopica di polifosfoinositidi 5-fosfatasi IV (5ptaseIV), un enzima che catalizza l'idrolisi di PM-specifica acida phosphatidylinositol- fosfolipidi (4,5) -bisphosphate [PI (4,5) P 2] per fosfatidilinositolo-4-fosfato, in cellule suggerito che Gag-PM localizzazione è mediata da PI (4,5) P 2 3,5. Tuttavia, gli studi in vitro che mira a comprendere i dettagli più meccanicistici di Gag-PI (4,5) P 2 interazioni hanno dimostrato di essere difficile per una serie di motivi. Peresempio, purificazione di full-length myristoylated HIV-1 Gag per esperimenti biochimici è stato tecnicamente difficile almeno in parte a causa della tendenza di Gag ad aggregarsi durante la purificazione. Quindi, le forme tronche di HIV-1 gag, come Myr-MA o Myr-MA-CA, o la forma non myristoylated sono stati spesso utilizzati in studi che necessitano di purificazione Gag (ad esempio, la risonanza magnetica nucleare, footprinting proteine, e la superficie risonanza plasmonica 6-9). In alternativa, accoppiato in reazioni di trascrizione-traduzione in vitro sono stati utilizzati per produrre full-length myristoylated HIV-1 Gag in altri studi biochimici 1,2. Tipicamente in questo sistema, un plasmide Gag-codifica è trascritta e tradotta con lisati cellulari eucariotiche (per esempio, lisati di reticolociti di coniglio) che sono privi di qualsiasi membrane cellulari e RNA messaggeri ma contengono i meccanismi di trascrizione e traduzione. Dopo la reazione, lisati cellulari contenenti Gag sono mescolati con membranes per l'analisi delle interazioni Gag con i lipidi. Oltre alla facilità di preparazione integrale myristoylated Gag, metodi che utilizzano il sistema di traduzione in vitro trascrizione hanno un vantaggio che la sintesi Gag e successiva membrana reazioni di legame si verificano in un ambiente 'eucariotica citosol-like' che possono rappresentare le condizioni fisiologiche. Questa struttura ha contribuito agli studi che hanno dimostrato che le molecole di RNA legate al dominio MA regolano Gag legame con lipidi acidi in modo competitivo 1,2,10-12. Tuttavia, poiché la quantità totale di proteine Gag ottenuti in questi lisati cellulari non sono elevati, marcatura metabolica delle proteine con amminoacidi radiomarcati necessarie per il loro rilevamento.
A seconda del metodo per misurare le interazioni Gag-lipidi, sono stati utilizzati una varietà di preparazioni di membrane. Ciascuno di questi metodi ha i suoi punti di forza e limiti. La maggior parte dei test NMR basati richiedono l'uso di lipidi con brevi acilecatene che sono solubili in acqua (per esempio, C4- e C8-PI (4,5) P 2) 6,8. Mentre i metodi NMR per testare legame di Gag ai lipidi che hanno catene acile da tempo trovato nelle cellule sono in fase di sviluppo, sono stati utilizzati soltanto con myristoylated o nonmyristoylated MA finora 8,13. In alternativa, liposomi preparati da lipidi che hanno catene lunghezza acilici nativi sono stati utilizzati in metodi biochimici come flottazione liposomi o fluorescenti tallone liposoma analisi di legame 2,3,10,14-16. Tuttavia, liposomi usati in questi test hanno piccolo diametro, e quindi le loro membrane hanno curvature ripidi e positivi. Al contrario, durante la prima fase di assemblaggio delle particelle nelle cellule HIV-1-infetti, Gag lega al PM, che è quasi planare sulla scala di Gag, e, successivamente, induce curvatura negativa durante erba. Pertanto, le membrane liposomi con curvatura ripida e positivo potrebbe non essere doppi strati lipidici ideali per studiare le interazioni Gag-lipidico. Per quanto riguarda i liposomi flotsaggi ation, un altro potenziale avvertimento è che l'esposizione di complessi Gag-lipidi a gradiente di saccarosio ipertonico durante la centrifugazione possono influenzare l'esito sperimentale. Per alleviare queste limitazioni e fornire un sistema sperimentale complementare, saggi per Gag legame giganti vescicole unilamellari (GUVs) sono stati sviluppati negli ultimi anni. GUVs sono vescicole doppio strato lipidico singoli i cui diametri estendersi a diverse decine di micrometri. Così, la curvatura di queste membrane analogo al PM sulla scala di Gag. Inoltre, grazie alle sue grandi dimensioni, che consente il controllo visivo in microscopi ottici, membrana vincolante proteine Gag di fluorescenza etichettati o etichettati a queste vescicole sulla miscelazione può essere facilmente determinato senza successiva elaborazione di complessi Gag-lipidici.
Abbiamo qui descritto un protocollo per studiare l'HIV-1 gag membrana vincolante utilizzando GUVs ottenuti da un metodo electroformation. Vari metodi come dolce idratazione, idratazione gel-assistita, microfonogetto rofluidic e electroformation 17-22 sono stati utilizzati per ottenere GUVs. Per il protocollo qui descritto, il metodo electroformation è utilizzato principalmente per la sua efficacia nel formare GUVs con lipidi acide e la sua relativa facilità di utilizzo, senza la necessità di configurazioni costosi. Dal momento che la visualizzazione di Gag necessita di un reporter fluorescente, giallo proteina fluorescente (YFP) è geneticamente aggiunto al C-terminale di Gag (Gag-YFP). Proteine Gag-YFP sono ottenute in vitro trascrizione e traduzione reazioni in a grano lisati germinali basato sulla tecnologia continuo scambio-flusso continuo (CECF). In questa tecnologia, sia la rimozione di sottoprodotti inibitori delle reazioni e fornitura di substrati di reazione e componenti energetiche vengono raggiunti in un meccanismo di dialisi a base. Per queste reazioni, è utilizzato un plasmide codificante Gag-YFP sotto il controllo di un promotore T7. Da segnalare, come illustrato in precedenza, lisati di germe di grano supportano myristoylation senza componenti aggiuntivi 23,24. Utilizzando questo metodo, è stato possibile ottenere una quantità sufficiente di full-length myristoylated Gag-YFP per la visualizzazione di Gag sulle membrane GUV 24. Qui si descrive il protocollo con cui legame HIV-1 gag a PI (4,5) P2 -contenenti membrane GUV può essere esaminato senza lunghe successiva elaborazione seguenti reazioni vincolanti e proporre che questo metodo complementare preesistente Gag-membrana test impegnativi e possono essere esteso a comprendere ulteriormente l'HIV-1 gag-membrana vincolante.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il saggio di legame GUV come descritto sopra fornisce una buona alternativa in scenari in cui altri test interazione proteina-lipide hanno i loro limiti. Questo test ci permette di esaminare le interazioni tra myristoylated Gag a figura intera e lipidi acidi con catene acilici lunghezza nativa nel contesto doppio strato lipidico e farlo senza lunghe centrifugazione di galleggiamento grazie ad alta densità gradienti di saccarosio o di altre lavorazioni di post-binding di Gag-lipidico complessi. Un altro vantaggio è che…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare Mohammad Saleem, Jing Wu e Krishnan Raghunathan per le discussioni utili. Ringraziamo anche Priya Begani per l'assistenza durante le riprese. Questo lavoro è sostenuto dal National Institutes of Health concede R01 AI071727 (Ao) e R01 GM110052 (a SLV).
Materials
| Digital Multimeter | Meterman | 30XR | A generic multimeter that can measure resistance and volts will serve the purpose. |
| Function Generator | Instek | GFG-8216A | A generic function generator that is capable of generating a sine wave at 10hz and 1V is sufficient. |
| ITO coated glass slides | Delta Technologies, Loveland, CO | CG-90IN | |
| Incubator | Hoefer | Any incubator that can accurately maintain temperature will be sufficient | |
| Vacuum chamber | Nalgene | ||
| Thermomixer R | Eppendorf | 21516-166 | |
| Syringe | Hamilton | 80400 | Gauge 22S, Syringe number 702 |
| PDMS | Sylgard elastomer base kit, Dow-Corning | Sylgard, 184 | |
| RTS 100 Wheat Germ CECF Kit | BiotechRabbit, Berlin, Germany |
BR1401001 | |
| DiD | Life Technologies, Carlsbad, CA | D7757 | |
| POPC | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL | 850457C | |
| POPS | Avanti Polar Lipids | 840034C | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700041P | |
| Brain-PI(4,5)P2 | Avanti Polar Lipids | 840046X |
References
- Chukkapalli, V., Inlora, J., Todd, G. C., Ono, A. Evidence in support of RNA-mediated inhibition of phosphatidylserine-dependent HIV-1 Gag membrane binding in cells. J Virol. 87 (12), 7155-7159 (2013).
- Chukkapalli, V., Oh, S. J., Ono, A. Opposing mechanisms involving RNA and lipids regulate HIV-1 Gag membrane binding through the highly basic region of the matrix domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (4), 1600-1605 (2010).
- Chukkapalli, V., Hogue, I. B., Boyko, V., Hu, W. S., Ono, A. Interaction between the human immunodeficiency virus type 1 Gag matrix domain and phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate is essential for efficient gag membrane binding. J Virol. 82 (5), 2405-2417 (2008).
- Zhou, W., Parent, L. J., Wills, J. W., Resh, M. D. Identification of a membrane-binding domain within the amino-terminal region of human immunodeficiency virus type 1 Gag protein which interacts with acidic phospholipids. J Virol. 68 (4), 2556-2569 (1994).
- Ono, A., Ablan, S. D., Lockett, S. J., Nagashima, K., Freed, E. O. Phosphatidylinositol (4,5) bisphosphate regulates HIV-1 Gag targeting to the plasma membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (41), 14889-14894 (2004).
- Saad, J. S., et al. Structural basis for targeting HIV-1 Gag proteins to the plasma membrane for virus assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11364-11369 (2006).
- Shkriabai, N., et al. Interactions of HIV-1 Gag with assembly cofactors. Biochemistry. 45 (13), 4077-4083 (2006).
- Vlach, J., Saad, J. S. Trio engagement via plasma membrane phospholipids and the myristoyl moiety governs HIV-1 matrix binding to bilayers. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3525-3530 (2013).
- Anraku, K., et al. Highly sensitive analysis of the interaction between HIV-1 Gag and phosphoinositide derivatives based on surface plasmon resonance. Biochemistry. 49 (25), 5109-5116 (2010).
- Llewellyn, G. N., Grover, J. R., Olety, B., Ono, A. HIV-1 Gag associates with specific uropod-directed microdomains in a manner dependent on its MA highly basic region. J Virol. 87 (11), 6441-6454 (2013).
- Inlora, J., Chukkapalli, V., Derse, D., Ono, A. Gag localization and virus-like particle release mediated by the matrix domain of human T-lymphotropic virus type 1 Gag are less dependent on phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate than those mediated by the matrix domain of HIV-1 Gag. J Virol. 85 (8), 3802-3810 (2011).
- Inlora, J., Collins, D. R., Trubin, M. E., Chung, J. Y., Ono, A. Membrane binding and subcellular localization of retroviral Gag proteins are differentially regulated by MA interactions with phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate and RNA. MBio. 5 (6), e02202 (2014).
- Valentine, K. G., et al. Reverse micelle encapsulation of membrane-anchored proteins for solution NMR studies. Structure. 18 (1), 9-16 (2010).
- Dick, R. A., Goh, S. L., Feigenson, G. W., Vogt, V. M. HIV-1 Gag protein can sense the cholesterol and acyl chain environment in model membranes. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (46), 18761-18766 (2012).
- Dick, R. A., Kamynina, E., Vogt, V. M. Effect of multimerization on membrane association of Rous sarcoma virus and HIV-1 MA proteins. J Virol. 87 (24), 13598-13608 (2013).
- Alfadhli, A., Still, A., Barklis, E. Analysis of human immunodeficiency virus type 1 matrix binding to membranes and nucleic acids. J Virol. 83 (23), 12196-12203 (2009).
- Rodriguez, N., Pincet, F., Cribier, S. Giant vesicles formed by gentle hydration and electroformation: a comparison by fluorescence microscopy. Colloids Surf B Biointerfaces. 42 (2), 125-130 (2005).
- Needham, D., McIntosh, T. J., Evans, E. Thermomechanical and transition properties of dimyristoylphosphatidylcholine/cholesterol bilayers. Biochemistry. 27 (13), 4668-4673 (1988).
- Darszon, A., et al. Reassembly of protein-lipid complexes into large bilayer vesicles: perspectives for membrane reconstitution. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (1), 239-243 (1980).
- Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discuss. Chem. Soc. (81), 303-311 (1986).
- Angelova, M. I., Soléau, S., Méléard, P. h., Faucon, F., Bothorel, P. Preparation of giant vesicles by external AC electric fields. Progr Colloid Polymer Sci. 89, 127-131 (1992).
- Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (12), 4697-4702 (2008).
- Yamauchi, S., et al. The consensus motif for N-myristoylation of plant proteins in a wheat germ cell-free translation system. FEBS J. 277 (17), 3596-3607 (2010).
- Olety, B., Veatch, S. L., Ono, A. Phosphatidylinositol-(4,5)-Bisphosphate Acyl Chains Differentiate Membrane Binding of HIV-1 Gag from That of the Phospholipase Cdelta1 Pleckstrin Homology Domain. J Virol. 89 (15), 7861-7873 (2015).
- Morales-Penningston, N. F., et al. GUV preparation and imaging: minimizing artifacts. Biochim Biophys Acta. 1798 (7), 1324-1332 (2010).
- Veatch, S. L. Electro-formation and fluorescence microscopy of giant vesicles with coexisting liquid phases. Methods Mol Biol. 398, 59-72 (2007).
- Ayuyan, A. G., Cohen, F. S. Lipid peroxides promote large rafts: effects of excitation of probes in fluorescence microscopy and electrochemical reactions during vesicle formation. Biophys J. 91 (6), 2172-2183 (2006).
- Montes, L. R., et al. Electroformation of giant unilamellar vesicles from native membranes and organic lipid mixtures for the study of lipid domains under physiological ionic-strength conditions. Methods Mol Biol. 606, 105-114 (2010).
- Olety, B., Ono, A. Roles played by acidic lipids in HIV-1 Gag membrane binding. Virus Res. 193, 108-115 (2014).
- Keller, H., Krausslich, H. G., Schwille, P. Multimerizable HIV Gag derivative binds to the liquid-disordered phase in model membranes. Cell Microbiol. 15 (2), 237-247 (2013).
- Carlson, L. A., Hurley, J. H. In vitro reconstitution of the ordered assembly of the endosomal sorting complex required for transport at membrane-bound HIV-1 Gag clusters. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (42), 16928-16933 (2012).
- Gui, D., et al. A novel minimal in vitro system for analyzing HIV-1 Gag-mediated budding. J Biol Phys. 41 (2), 135-149 (2015).
- Prevost, C., et al. IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules. Nat Commun. 6, 8529 (2015).
