Nephrotoxin Microinjection דג הזברה למודל אי-ספיקת כליות חריפה
Summary
פציעות כליות הנגרמות nephrotoxins, הכולל תרופות החל אנטיביוטיקה כימותרפיות, שיכולות לגרום להפרעות מורכבות בפתוגנזה ששרידיו מובנים. פרוטוקול זה מדגים כיצד דג הזברה יכול לשמש בסיס לפיתוח מודלים למחלות של תנאים אלה, אשר יכול להיות מיושם על זיהוי של צעדים renoprotective.
Abstract
הכליות הן רגישות לפגוע מחשיפה לכימיקלים שהם לסנן ממחזור הדם. זה יכול להוביל לפציעת איבר הקשורים ירידה מהירה בתפקוד הכלייתי ופיתוח של התסמונת הקלינית המכונית אי-ספיקת כליות חריפה (AKI). סוכנים תרופתיים המשמשים לטיפול נסיבות רפואיות החל זיהום חיידקים לסרטן, כאשר מנוהלים בנפרד או בשילוב עם תרופות אחרות, יכולים ליזום AKI. דג זברה היא מודל חיה כדאי ללמוד את ההשפעות הכימיות על תפקוד כלייתי in vivo, כפי שהם יוצרים כליה עוברית המורכבת מיחידות פונקציונליות נפרון כי הם משומרים עם חוליות גבוהות, כולל בני אדם. יתר על כן, דג זברה יכול להיות מנוצל כדי לבצע מסך גנטי וכימי, המספק הזדמנויות להבהיר את ההיבטים התאיים ומולקולריים של AKI ולפתח אסטרטגיות טיפוליות כגון זיהוי של מולקולות כליה. הנה, אנחנו מדגימים microinjection איך לתוךעובר דג זברה יכול להיות מנוצל כפרדיגמה מחקרי nephrotoxin.
Introduction
AKI הוא אובדן פתאומי של בתפקוד הכליות, אשר יכול להוביל לתוצאות הרסניות לבריאות 1. AKI הוא נושא בריאות משמעותי ברחבי העולם בשל שכיחותה הגבוהה של כ -20% בקרב חולים מאושפזים, עם אף גבוהים יותר שיעורים 30-50% במקרים בטיפול נמרצים והקשישים, ושיעורי תמותה של 50-70% 1-3. למרבה הצער, השכיחות של AKI גדלה והוא צפוי להסלים עוד יותר בעשור הקרוב, בין שאר כתוצאת המגוון של גורמים שיכולים לגרום AKI, הכולל שלאחר ניתוח מתח, איסכמיה, וחשיפת nephrotoxins כגון אנטיביוטיקה תרופות כימותרפיות 4.
AKI כרוך ניזק לתאים פתאומי בתוך הכליה, שכיח ב nephrons, שהן היחידות הפונקציונליות החיוניות, והם מורכבים של מסנן דם וכן אבובית מפולחת המנקזת שתנו לתוך צינוריות איסוף מרכזיות 1. כאשר מספר לא מבוטל של nephrons הואניזוק במהלך AKI, ההשפעות המיידיות כוללות הפרעה בסילוק פסולת מהמחזור, ואת זרימת נוזל מופחת או בוטלו באמצעות nephrons עקב חסימה מתאי מתים וגוססים 1. במשך הזמן, חסימה צינורי יכול להוביל לניוון של nephrons כולו, אשר מפחית 1 תפקוד כלייתי לצמיתות. שינויים פיסיולוגיים הכליה הבאה AKI גם הקשורות בתופעות דלקתיות מורכבות שיכולים להוביל צלקות כרוניות 1.
למרות התוצאות הללו, nephrons יש כמה היכולת לעבור התחדשות לאחר AKI כי reconstitutes 5,6 אפיתל צינורי. אמנם יש כבר הבנה מולקולרית גדל והולך של התחדשות נפרון, המנגנונים להישאר חמקמקה לגבי רבים מחייבים המשך חקירה 7. המידה שבה AKI גורם לנזק כלייתי קבע גם נותר עלום. המחקר הנוכחי מצביע על פוטנציאל ההתחדשות עבור הכליה הואגבוה ביותר בעקבות מקרים חמורים פחות של AKI, בעוד יותר פרקים בולטים או חוזרים להוביל מחלת כליות כרונית (CKD) ותסתיים ב סופנית מחלת כליות (ESRD) הדורש השתלת מצילות חיים או דיאליזה 8,9. בנוסף, אנשים שכבר סובלים CKD נמצאים בסיכון גבוה עוד יותר להידבקות פרק חמור של AKI 8,9. יחדיו, ברור שהמשך מחקר בסיסי וקליני חיוני להבין, לטפל ולמנוע AKI.
מחקר במודלים של בעלי חיים כבר סייע להעריך את ההתקדמות של שינויים מקומיים וסביבתיים המתרחשים במהלך AKI 10. כדי להרחיב את ההבנה הזאת, כמו גם לפתח טיפולים חדשים, במודל חיה דג הזברה כבר המועסקים במגוון דרכים 11,12. Nephrons של הכליה דג הזברה, בשני העובר מבוגר, להציג רמה גבוהה של שימור עם יונקים 13-16. יתר על כן, פגיעה אפיתל נפרון ב zebrafish דומה לתהליך חוליות גבוהות, לפיה ההרס המקומי של תאים צינורי ואחריו התפשטות intratubular ואת הקמתה מחדש של נפרון אדריכלות 17-19. בעובר, אולם ניזק אבובית נרחב מן nephrotoxins כמו ציספלטין קשור קטלני 20,21. לשם השוואה, מבוגרי דג זברה לשרוד AKI ולהציג יכולות משובים מהותיות הכליות. כך למשל, בעקבות החשיפה גנטמיצין אנטיביוטי aminoglycoside, דג הזברה להתחדש נזק אפיתל אבובית ולגדול יחידות נפרון חדשים וכן 22-24. בעוד גנטמיצין הנגרמת אלה מחקרים AKI סיפקו מידע שלא יסולא בפז, להבנת נזק כלייתי מ nephrotoxins מגוונים נותר קריטי להעריך את ההשפעות בתגובה סוגים שונים של נזק 25.
עובר דג הזברה, בשל גודלו, שקיפות עקיבות גנטיות, יש יתרונות רבים ללימודי nephrotoxin <sup> 25, שבהם השיטה של microinjection 20,21 משמשת לניהול המולקולה (ים) לחקירה. Nephrons נוצרות על ידי הפריה 24 שעות שלאחר (hpf) ומתחילים לסנן דם בכ 48 hpf 26,27. לפיכך, ההיווצרות המהירה והתפקוד של הכליה העוברית מאפשרים ניתוח הניסיון. עם זאת, תהליך של microinjection יש אתגרים טכניים ויש יכול להיות עקומת למידה תלולה מאסטרינג טכניקה. במאמר זה וידאו, אנו מתארים כיצד לבצע microinjections ולספק עצות לפתרון בעיות כדי להגביר את שיעור זריקות מוצלחות.
Protocol
Representative Results
Discussion
מספר רחב של סוכנים טיפוליים קושר עם AKI 29. היו מקדמות מחקר משמעותי בהבנת הנזק הנגרמת על ידי תרכובות בודדים רבים, כגון גנטמיצין aminoglycoside 30 ו ציספלטין כימותרפיות בשימוש נרחב 31,32. שינויים פתולוגיים מסוימים מעורבים בתנאים אלה, עם זאת, להישאר בנושא של מחקר מ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי DP2OD008470 מענק NIH. בנוסף, זיכרון RAM נתמך בחלקו על ידי קרנות הניתנים על ידי אוניברסיטת בית הספר למוסמכים נוטרדאם. אנו מודים לצוות המחלקה למדעי הביולוגיה, המרכז הזברה מחקר, והמרכז בתאי גזע משובי רפואה באוניברסיטת נוטרדאם. תודה מיוחדת לחברי מעבדה לעיסוק דיונים על ביולוגית כליות ומשוב המועילות על עבודה זו.
Materials
| Sodium Chloride | American Bioanalytical | AB01915 | |
| Potassium Chloride | American Bioanalytical | AB01652 | |
| Calcium Chloride | American Bioanalytical | AB00366 | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Aldrich Chemistry | P7629 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate (Tricaine) | Fluka Analytical | A5040 | |
| Borosilicate glass | Sutter Instruments Co. | BF100-50-10 | |
| Flaming/Brown Micropipette puller | Sutter Instruments Co. | Mo. P097 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile, Corning: | |||
| 60mm x 15mm | VWR | 25373-085 | |
| 100mm x 15mm | VWR | 25373-100 | |
| (microinjection tray) 150mm x 15mm | VWR | 25373-187 | |
| Low Temperature Incubator | Fischer Scientific | 11 690 516DQ | |
| Micro Dissecting Tweezer | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5010 | |
| Micrometer | Ted Pella, Inc. | 2280-24 |
References
- Basile, D. P., Anderson, M. D., Sutton, T. A. Pathophysiology of acute kidney injury. Compr. Physiol. 2, 1303-1353 (2012).
- Ostermann, M. Diagnosis of acute kidney injury: kidney disease improving global outcomes criteria and beyond. Curr. Opin. Crit. Care. 20, 581-587 (2014).
- Fluck, R. J. Acute kidney: improving the pathway of care for patients and across healthcare. Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 24, 511-516 (2015).
- Silver, S. A., Cardinal, H., Colwell, K., Burger, D., Dickhout, J. G. Acute kidney injury: preclinical innovations, challenges, and opportunities for translation. Can. J Kidney Health Dis. 2, 30 (2015).
- McCampbell, K. K., Wingert, R. A. Renal stem cells: fact or science fiction?. Biochem. J. 444, 153-168 (2012).
- Li, Y., Wingert, R. A. Regenerative medicine for the kidney: stem cell prospects and challenges. Clin. Transl. Med. 2, 11 (2013).
- Romagani, P., Lasagni, L., Remuzzi, G. Renal progenitors: an evolutionary conserved strategy for kidney regeneration. Nat. Rev. Nephrol. 9, 137-146 (2013).
- Kline, J., Rachoin, J. S. Acute kidney injury and chronic kidney disease: it’s a two-way street. Ren. Fail. 35, 452-455 (2013).
- Chawla, L. S., Kimmel, P. L. Acute kidney injury and chronic kidney disease: an integrated clinical syndrome. Kidney Int. 82, 516-524 (2012).
- Sanz, A. B., Sanchez-Niño, M. D., Martìn-Cleary, C., Ortiz, A., Ramos, A. M. Progress in the development of animal models of acute kidney injury and its impact on drug discovery. Expert Opin. Drug Discov. 8, 879-895 (2013).
- McCampbell, K. K., Wingert, R. A. New tides: using zebrafish to study renal regeneration. Transl Res. 163, 109-122 (2014).
- McKee, R. A., Wingert, R. A. Zebrafish renal pathology: emerging models of acute kidney injury. Curr. Pathobiol. Rep. 3, 171-181 (2015).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney Int. 73, 1120-1127 (2008).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals from retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
- McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney. J. Vis. Exp. (90), e51644 (2014).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. J. Vis. Exp. (54), e2845 (2011).
- Palmyre, A., et al. Collective epithelial migration drives kidney repair after acute injury. PLoS One. 9, e101304 (2014).
- Fogelgren, B., et al. Exocyst Sec10 protects renal tubule cells from injury by EGFR/MAPK activation and effects on endocytosis. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 307, F1334-F1341 (2014).
- Hentschel, D. M., Park, K. M., Cilenti, L., Zervox, A. S., Drummond, I. A., Bonventre, J. V. Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 288, F923-F929 (2005).
- Cosentino, C. C., Roman, B. L., Drummond, I. A., Hukriede, N. A. Intravenous microinjections of zebrafish larvae to study acute kidney injury. J. Vis. Exp. (42), e2079 (2010).
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 299, F1040-F1047 (2010).
- Diep, C. Q., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470, 95-101 (2011).
- McCampbell, K. M., Springer, K. N., Wingert, R. A. Atlas of cellular dynamics during zebrafish adult kidney regeneration. Stem Cell Int. , 547636 (2015).
- Sharma, P., Sharma, S., Patial, V., Singh, D., Padwad, Y. S. Zebrafish (Danio rerio): a potential model for nephroprotective drug screening. Clinical Queries: Nephrol. 3, 97-105 (2014).
- Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 559-585 (2013).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Hanke, N., et al. ‘Zebrafishing’ for novel genes relevant to the glomerular filtration barrier. Biomed. Res. Int. 2013, 658270 (2013).
- Kane-Gill, S. L., Goldstein, S. L. Drug-induced acute kidney injury: a focus on risk assessment for prevention. Crit. Care Clin. 31, 675-684 (2015).
- Lopez-Novoa, J. M., Quiros, Y., Vicente, L., Morales, A. I., Lopez-Hernandez, F. J. New insights into the mechanism of aminoglycoside nephrotoxicity: an integrative point of view. Kidney Int. 79, 33-45 (2010).
- Ozkok, A., Edelstein, C. L. Pathophysiology of cisplatin-induced acute kidney injury. Biomed. Res. Int. 2014, 967826 (2014).
- Perazella, M. A., Moeckel, G. W. Nephrotoxicity from chemotherapeutic agents: clinical manifestations, pathobiology, and prevention/therapy. Semin. Nephrol. 30, 570-581 (2010).
- Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Recent advances in elucidating the genetic mechanisms of nephrogenesis using zebrafish. Cells. 4, 218-233 (2015).
- Pickart, M. A., Klee, E. W. Zebrafish approaches enhance the translational research tackle box. Transl. Res. 163, 65-78 (2014).
- Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization. J. Vis. Exp. (89), e51604 (2014).
- Galloway, J. L., Wingert, R. A., Thisse, C., Thisse, B., Zon, L. I. Combinatorial regulation of novel erythroid gene expression in zebrafish. Exp. Hematol. 36, 424-432 (2008).
- McKee, R., Gerlach, G. F., Jou, J., Cheng, C. N., Wingert, R. A. Temporal and spatial expression of tight junction genes during zebrafish pronephros development. Gene Expr. Patterns. 16, 104-113 (2014).
- Li, Y., Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Zebrafish nephrogenesis is regulated by interactions between retinoic acid, mecom, and Notch signaling. Dev. Biol. 386, 111-122 (2014).
- Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Zebrafish pronephros tubulogenesis and epithelial identity maintenance are reliant on the polarity proteins Prkc iota and zeta. Dev. Biol. 396, 183-200 (2014).
- Cheng, C. N., Wingert, R. A. Nephron proximal tubule patterning and corpuscles of Stannius formation are regulated by the sim1a transcription factor and retinoic acid in the zebrafish. Dev. Biol. 399, 100-116 (2015).
- Lessman, C. A. The developing zebrafish (Danio rerio): A vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries. Birth Defects Res. C Embryo Today. 93, 268-280 (2011).
- Poureetezadi, S. J., Wingert, R. A. Congenital and acute kidney disease: translational research insights from zebrafish chemical genetics. Gen. Med. 1, 112 (2013).
- Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., Wingert, R. A. A manual small molecule screen approaching high-throughput using zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (93), e52063 (2014).
- Peng, H. C., Wang, Y. H., Wen, C. C., Wang, W. H., Cheng, C. C., Chen, Y. H. Nephrotoxicity assessments of acetaminophen during zebrafish embryogenesis. Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 151, 480-586 (2010).
- Wu, T. S., Yang, J. J., Yu, F. Y., Liu, B. H. Evaluation of nephrotoxic effects of mycotoxins, citrinin and patulin, on zebrafish (Danio rerio) embryos. Food Chem. Toxicol. 50, 4398-4404 (2012).
- Ding, Y. J., Chen, Y. H. Developmental nephrotoxicity of aristolochic acid in a zebrafish model. Toxicol. Appl. Pharmacol. 261, 59-65 (2012).
- Zennaro, C., et al. Podocyte developmental defects caused by adriamycin in zebrafish embryos and larvae: a novel model of glomerular damage. PLoS One. 9, e98131 (2014).
- Ding, Y. J., Sun, C. Y., Wen, C. C., Chen, Y. H. Nephroprotective role of resveratrol and ursolic acid in aristolochic acid intoxicated zebrafish. Toxins. 7, 97-109 (2015).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (27), e1115 (2009).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
- Christou-Savina, S., Beales, P. L., Osborn, D. P. Evaluation of zebrafish kidney function using a fluorescent clearance assay. J. Vis. Exp. (96), e52540 (2015).
