Nephrotoxin Mikroinjektion in Zebrabärbling akuten Nierenschädigung zu Modell
Summary
Renal Verletzungen von Nephrotoxinen entstehen, die Medikamente im Bereich von Antibiotika zu Chemotherapeutika gehören, können in komplexen Erkrankungen, deren Pathogenese zur Folge bleibt unvollständig verstanden. Dieses Protokoll zeigt, wie Zebrabärbling für Krankheitsmodelle dieser Bedingungen verwendet werden, die zur Identifizierung von renoprotektive Maßnahmen angewendet werden können.
Abstract
Die Nieren sind anfällig von der Exposition zu schädigen zu Chemikalien, die sie aus dem Blut zu filtern. Dies kann mit einem raschen Rückgang der Nierenfunktion und die Entwicklung des klinischen Syndrom bekannt als akute Nierenschädigung (AKI) in Verbindung zu Organschäden führen. Pharmakologischer Mittel verwendet, um medizinische Bedingungen zur Behandlung von bakteriellen Infektionen zu Krebs reichen, wenn sie einzeln verabreicht werden oder in Kombination mit anderen Wirkstoffen, kann AKI initiieren. Zebrabärbling sind ein nützliches Tiermodell die chemischen Wirkungen auf die Nierenfunktion in vivo zu untersuchen, da sie eine embryonale Niere Nephron Funktionseinheiten besteht bilden , die mit höheren Vertebraten konserviert sind, einschließlich Menschen. Ferner kann Zebrabärbling genetische und chemische Bildschirme auszuführen verwendet werden, die Möglichkeiten bieten, um die zellulären und molekularen Facetten AKI aufzuklären und therapeutischen Strategien wie die Identifizierung von Molekülen nephroprotektive entwickeln. Hier zeigen wir, wie die Mikroinjektion in dieZebrafischembryo kann als Paradigma für Nephrotoxin Studien genutzt werden.
Introduction
AKI ist ein abrupter Verlust der Nierenfunktion , die 1 bis verheerenden gesundheitlichen Folgen führen kann. AKI ist ein bedeutendes Gesundheits Problem weltweit aufgrund seiner hohen Inzidenz von etwa 20% bei Patienten im Krankenhaus, mit noch höheren Raten von 30-50% in kritischen Pflegefälle und ältere Menschen, und die Sterblichkeitsrate von 50-70% 1-3. Leider hat sich die Prävalenz von AKI zugenommen und wird voraussichtlich weiter über die nächsten zehn Jahre zu eskalieren, zum Teil aufgrund der Vielfalt der Faktoren, die AKI auslösen können, zu denen die postoperative Belastung, Ischämie und Exposition gegenüber Nephrotoxinen wie Antibiotika und chemotherapeutischen Arzneimitteln 4.
AKI beinhaltet plötzliche Zellschäden in der Niere, die gemeinhin in Nephronen auftretenden, die die wesentlichen Funktionseinheiten sind, und aus einem Blutfilter und einer segmentierten tubule umfasst , die Urin in den zentralen Sammelrohre 1 entwässert. Wenn eine erhebliche Anzahl von Nephronen sindwährend AKI beschädigt, sind die unmittelbaren Auswirkungen einer Unterbrechung in der Abfall Clearance aus dem Kreislauf und reduziert oder außer Kraft gesetzt Fluidstrom durch Nephronen durch Obstruktion von toten und sterbenden Zellen 1. Im Laufe der Zeit können Rohr Behinderung zu einer Degeneration des gesamten Nephronen führen, die 1 Nierenfunktion reduziert dauerhaft. Physiologische Veränderungen in der Niere folgenden AKI beinhalten auch komplexe entzündliche Ereignisse , die zu chronischen Vernarbung 1 führen kann.
Trotz dieser Ergebnisse haben Nephronen gewisse Fähigkeit Regeneration nach AKI zu unterziehen, die die Tubulusepithel 5,6 rekonstituiert. Zwar gibt es eine wachsende molekulare Verständnis von nephron Regeneration gewesen ist, bleiben die Mechanismen schwer in vielerlei Hinsicht und erforderlich machen Untersuchung 7 fortgesetzt. Das Ausmaß, in dem AKI führt zu einer dauerhaften Nierenschädigung bleibt ebenfalls unbekannt. Die aktuelle Forschung deutet darauf hin, das regenerative Potenzial für die Niere ist diehöchste folgenden weniger schwere Fälle von AKI, während ausgeprägter oder wiederholte Episoden zu einer chronischen Nierenerkrankung (CKD) führen und in Nierenerkrankung im Endstadium (ESRD) , die lebensrettende Transplantation oder Dialyse erfordert 8,9 gipfeln. Darüber hinaus Personen , die bereits von CKD leiden , sind zu einem noch höheren Risiko von 8,9 eine schwere Folge von AKI Vertrags. Zusammengenommen ist es klar, dass die weitere Grundlagen- und klinische Forschung zu verstehen, von entscheidender Bedeutung ist, zu behandeln und AKI verhindern.
Forschung mit Tiermodellen hat in Würdigung der Progression der lokalen und ökologischen Veränderungen beigetragen , die während der AKI 10 auftreten. Um dieses Verständnis zu erweitern sowie die Entwicklung neuer Therapien, die Zebrabärbling Tiermodell wurde in einer Vielzahl von Möglichkeiten 11,12 eingesetzt. Die Nephronen der Zebrabärbling Niere, sowohl im Embryo und Erwachsenen zeigen einen hohen Grad an Konservierung bei Säugetieren 13-16. Ferner nephron epithelialen Verletzungen in zeFisch – ähnelt dem Prozess bei höheren Wirbeltieren, wobei die lokale Zerstörung von röhrenförmigen Zellen durch intratubulären Proliferation und Wiederherstellung der nephron Architektur 17-19 folgt. Im Embryo ist jedoch umfangreiche Röhrchens Schaden von den Nephrotoxinen wie Cisplatin im Zusammenhang mit Letalität 20,21. Zum Vergleich: überleben Zebrabärbling Erwachsene AKI und zeigen materielle regenerative Fähigkeiten in der Niere. Zum Beispiel, um das Aminoglykosid – Antibiotikum Gentamicin nach der Exposition, Zebrabärbling Röhrchens Epithelschädigung regenerieren und neue Nephron – Einheiten sowie 22-24 wachsen. Während diese Gentamicin-induzierten AKI Studien wertvolle Informationen zur Verfügung gestellt haben, Nierenschäden aus verschiedenen Nephrotoxinen Verständnis bleibt entscheidend , um die Auswirkungen und die Reaktion auf verschiedene Arten von Schäden 25 zu schätzen.
Der Zebrafischembryo, aufgrund seiner Größe, Transparenz und genetische Lenkbarkeit, hat viele Vorteile für Nephrotoxin Studien <sup> 25, wobei das Verfahren der Mikroinjektion 20,21 verwendet, um das Molekül (e) für die Untersuchung zu verabreichen. Nephron werden von 24 Stunden nach der Befruchtung (HPF) und beginnen zu filtern Blut von etwa 48 HPF 26,27 gebildet. Somit erleichtert die schnelle Bildung und Funktion der embryonalen Nieren experimentellen Analyse. Allerdings hat der Prozess der Mikroinjektions technischen Herausforderungen, und es kann eine steile Lernkurve zu Beherrschung der Technik sein. In diesem Video-Artikel beschreiben wir, wie Mikroinjektionen durchführen und Tipps zur Fehlerbehebung, um die Rate der erfolgreichen Injektionen bieten zu verbessern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eine vielfältige Anzahl von therapeutischen Wirkstoffen wurden mit AKI 29 verbunden. Es wurden von vielen einzelnen Verbindungen, wie das Aminoglycosid Gentamicin 30 und dem weit verbreiteten chemotherapeutischen Cisplatin induzierte Schäden beim Verständnis 31,32 signifikante Fortschritte in der Forschung gewesen. Einige pathologische Veränderungen dieser Bedingungen beteiligt sind, bleiben jedoch Gegenstand der laufenden Studie. Ein entstehender Herausforderung bleibt das Verständ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde teilweise durch die NIH Zuschusses DP2OD008470 unterstützt. Zusätzlich RAM wurde von Fonds, die von der University of Notre Dame Graduate School zur Verfügung gestellt teilweise unterstützt. Wir danken den Mitarbeiter der Abteilung für Biologische Wissenschaften, das Zentrum für Zebrabärblinge Forschung, und das Zentrum für Stammzellen und regenerative Medizin an der University of Notre Dame. Wir danken vor allem den Mitgliedern des Labor für Diskussionen über Nieren Biologie und ihre hilfreichen Feedback zu dieser Arbeit engagieren.
Materials
| Sodium Chloride | American Bioanalytical | AB01915 | |
| Potassium Chloride | American Bioanalytical | AB01652 | |
| Calcium Chloride | American Bioanalytical | AB00366 | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Aldrich Chemistry | P7629 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate (Tricaine) | Fluka Analytical | A5040 | |
| Borosilicate glass | Sutter Instruments Co. | BF100-50-10 | |
| Flaming/Brown Micropipette puller | Sutter Instruments Co. | Mo. P097 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile, Corning: | |||
| 60mm x 15mm | VWR | 25373-085 | |
| 100mm x 15mm | VWR | 25373-100 | |
| (microinjection tray) 150mm x 15mm | VWR | 25373-187 | |
| Low Temperature Incubator | Fischer Scientific | 11 690 516DQ | |
| Micro Dissecting Tweezer | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5010 | |
| Micrometer | Ted Pella, Inc. | 2280-24 |
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