관측 및 텔로미어의 정량 및 반복 시퀀스 사용하여 형광<em> 현장에서</emPNA 프로브에와> 하이브리드 (FISH)<em> 예쁜 꼬마 선충</em

Summary

We report a concise procedure of fluorescence in situ hybridization (FISH) in the gonad and embryos of Caenorhabditis elegans for observing and quantifying repetitive sequences. We successfully observed and quantified two different repetitive sequences, telomere repeats and template of alternative lengthening of telomeres (TALT).

Abstract

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase or an alternative pathway, known as alternative lengthening of telomeres (ALT)¹. Recently, C. elegans has emerged as a multicellular model organism for the study of telomere and ALT². Visualization of repetitive sequences in the genome is critical in understanding the biology of telomeres. While telomere length can be measured by telomere restriction fragment assay or quantitative PCR, these methods only provide the averaged telomere length. On the contrary, fluorescence in situ hybridization (FISH) can provide the information of the individual telomeres in cells. Here, we provide protocols and representative results of the method to determine telomere length of C. elegans by fluorescent in situ hybridization. This method provides a simple, but powerful, in situ procedure that does not cause noticeable damage to morphology. By using fluorescently labeled peptide nucleic acid (PNA) and digoxigenin-dUTP-labeled probe, we were able to visualize two different repetitive sequences: telomere repeats and template of ALT (TALT) in C. elegans embryos and gonads.

Introduction

텔로미어는 비정상적인 융합 저하로부터 염색체 끝 부분을 보호합니다. 포유류 텔로미어는 G-풍부한 hexameric 반복, TTAGGG 및 shelterin 단지로 구성되어있다. 선충의 텔로미어 반복 서열은 포유 동물 (TTAGGC)의 그것과 유사하다. 대부분의 진핵 세포는 염색체 말단에 텔로미어의 반복을 추가하는 텔로 머라 제를 사용한다. 그러나, 10 – 암세포의 15 % 텔로미어 (ALT) ^3의 대안 길어 알려진 텔로 머라 독립 메커니즘을 이용한다. 이전에, 우리는 텔로미어의 반복과 TALT라는 이름으로 관련 시퀀스가 중요한 ^{불임이 살아} 텔로 머라 돌연변이 라인의 텔로미어에서 증폭 된 보도했다.

텔로미어 길이를 정량적 PCR에 의해 또는 전체 ^-4,5,6,7- 텔로미어의 평균 길이를 제공 서던 블롯에 의해 측정 하였다. 전체 게놈 시퀀싱 데이터에서 텔로미어 반복의 읽기 횟수는 총 텔로미어의 내용 ^(8)의 지표입니다. 죄 있지만GLE 텔로미어 길이 분석 (STELA) 단일 텔로미어의 길이가,이 텔로미어 ^(9)의 공간 정보를 제공 할 수 제공 할 수있다. POT-1 :: mCherry 리포터 단백질이 생체 내에서 텔로미어의 공간 정보를 제공하는 반면 POT-1 단백질 ^(10)을 결합 단일 가닥 텔로미어이기 때문에, 그것은 이중 가닥 말단 소립의 길이를 나타낼 수 없다.

상기 방법은 반복적 인 시퀀스의 평균 정보를 제공하는 반면, 현장 하이브리드 (FISH)의 형광 염색체 규모에 금액과이자의 개별 시퀀스의 공간 패턴을 관찰 할 수 있습니다. 대신 DNA의 정제, 조직 또는 세포는 FISH에서 기본 공간 정보를 보존하기 위해 고정되어있다. 따라서, FISH는 텔로미어 반복 개별 반복 서열의 관찰을위한 양적 및 질적 도구입니다.

이 프로토콜은 모두 telo의 동시 검출을위한 효율적인 방법을 제공단순한 및 기타 반복 이전에 기술 된 방법 ^{(11, 12)에서} 개선을 기반으로. C. 엘레 유충 또는 성인 고도로 분화 된 세포와 다세포 유기체이다. 세포의 텔로미어 이질성 스폿 다수의 정량적 분석을 방해한다. 분석 된 세포의 수를 최대화하기 위해 배아 절연 및 FISH 용 폴리 리신 코팅 된 슬라이드에 도포한다. 또한,이 프로토콜은 또한 면역와 결합 될 수있다.

프로토콜이 동작하는 증거로서, 우리는 두 가지 관찰 반복 서열을 정량화 할 수 있음을 보여준다. TALT1에 대한 DNA 프로브는 간단한 PCR은 디그 옥시 제닌-dUTP를 통합하여 생성되었습니다. 그런 다음이 TALT1 프로브와 형광 표지 텔로미어 PNA 프로브를 동시에 하이브리드 하였다. 그 후, 디그 옥시 제닌은 표준 면역 형광 방법에 의해 검출되었다. 우리는 여기 TALT1는 TRT-1의 텔로미어와 colocalized 대표 이미지를 제시 </em은> 생존자.

Protocol

PCR에 의한 디그 옥시 제닌 dUTP를 1. 레이블 프로브 이전 13 설명 ​​된대로 10 배의 dNTP 믹스 디그 옥시 제닌 dUTP를을 포함하여 PCR 라벨링을 수행합니다. 제조자의 지시에 따라 스핀 컬럼으로 정제 PCR 생성물을 정제 하였다. 프로브가 짧을 200 bp의 경우, 반응 혼합물로부터 스핀 – 컬럼 크로마토 그래피보다는 스핀 칼럼 정제 무료 디그 옥시 제닌 dUTP를 제거. …

Representative Results

그것은 이전에 해당 ALT 생존자는 내부적으로 'ALT의 템플릿'(TALT) 텔로미어 유지 보수 2 시퀀스 지역화 복제하여 낮은 주파수에서, TRT-1 (ok410), 텔로 머라 아제가 결핍 된 돌연변이 체에서 나타날 수 있습니다보고되었다. PNA 프로브를 사용하여, 우리는 해부 생식선 (도 2A)에서 텔로미어를 시각화 할 수 있었다. 희미한 텔로미어 신호에 TRT-1…

Discussion

우리 프로토콜의 주요 장점은 세포 구조의 형태로 눈에 띄는 손상없이 절차의 단순함이다. 여러 단계 C.에 최적화 된 이 프로토콜에 간스의 물고기. 성공적인 FISH를위한 중요한 단계는 프로브의 라벨, 배아 및 침투의 고정을 포함한다. 디그 옥시 제닌 표지 된 dUTP의 방법은, PCR이나 닉 – 번역에 의해 사용하기 쉬운 표시 방법을 제공한다. 긴 표적 서열 레이블을 지정하려면, 닉 번역이 ?…

Materials

PNA probe	PANAGENE	custom order
Anti-Digoxigenin-Fluorescein, Fab fragments	Roche	11207741910	use 1:200 diluted in PBST
Digoxigenin-dUTP	Roche	11573152910
Bovine serum albumin	SIGMA-ALDRICH	A-7906
Paraformaldehyde	SIGMA-ALDRICH	P-6148	prepare 4% paraformaldehyde by heating in DW with few drops of NaOH. add 0.1 volume of 10x PBS.
Vectashield	Vector Laboratories	H-1200
Hybridizaiton solution			3X SSC, 50% formamide, 10% (w/v) dextran sulfate, 50 ug/ml heparin, 100 ug/ml yeast tRNA , 100ug/ml sonicated salmon sperm DNA
Hybridizaiton wash solution			2X SSC, 50% formamide
Formamide	BIONEER	C-9012	toxic
Methanol	Carlo Erba
Acetone	Carlo Erba
Heparin	SIGMA-ALDRICH	H3393	make 10 mg/ml for stock solution
Dextran sulfate	SIGMA-ALDRICH	67578
10X PBS			For 1 Liter DW : 80 g NaCl, 2.0 g KCl, 27 g Na2HPO4:7H2O, 2.4 g KH2PO
PBST			1X PBS, 0.1% tween-20
Polysorbate 20	SIGMA-ALDRICH	P-2287	Commercial name is Tween-20
Poly-L-Lysine solution (0.1 % w/v)	SIGMA-ALDRICH	P-8920	prepare fresh 0.01 % w/v solution before use
M9			3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 L
Bleaching solution			20% sodium hypochlorite, 0.5 M KOH
Antibody buffer			1X PBST, 1mM EDTA, 0.1% BSA, 0.05% Sodium azide (toxic)
Blocking solution			Antibody buffer with 5% bovine serum albumin (BSA)
illustra Microspin G-50	GE healthcare	27-53310-01
20X SSC			To make 1L, 175.3 g of NaCl, 88.2 g of sodium citrate, H2O to 1 L, adjust pH to 7.0
2X SSCT			2X SSC, 0.1 % tween-20
10x digoxigenin-dUTP mix			1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0.65mM dTTP, 0.35mM DIG-11-dUTP
PCR purification columns	Cosmo genetech	CMR0112
Glass cleaner / ULTRA CLEAN	Dukssan pure chemicals	8AV721
Multi-well glass slide	MP biomedicals	96041205
Nematode growth media			to make 1 L, 3 g of NaCl, 17 g of agar, 2.5 g of peptone, H2O to 974 mL. Autoclave and cool the flask. Add 1 mL of 1M CaCl2, 1 ml of 4 mg/mL cholesterol in ethanol, 1 ml of 1 M MgSO4, 25 mL of 1 M KPO4.
Levamisole	SIGMA-ALDRICH	196142
Razor	Feather	blade No. 11
Rnase A	Enzynomics
BSA	SIGMA-ALDRICH	A7906
Equipments
Confocal microsope	Zeiss	LSM 510	EC Plan-Neofluar 100x was used as objective lens.
Dry block / aluminum block	Labtech	LBH-T03	Set temperature to 80℃
Humid chamber			Plastic box filled with paper towel soaked in DW
Image Analysis Software	Dr. Peter Landsdorp	TFL-telo	http://www.flintbox.com/public/project/502