We report a concise procedure of fluorescence in situ hybridization (FISH) in the gonad and embryos of Caenorhabditis elegans for observing and quantifying repetitive sequences. We successfully observed and quantified two different repetitive sequences, telomere repeats and template of alternative lengthening of telomeres (TALT).
Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase or an alternative pathway, known as alternative lengthening of telomeres (ALT)1. Recently, C. elegans has emerged as a multicellular model organism for the study of telomere and ALT2. Visualization of repetitive sequences in the genome is critical in understanding the biology of telomeres. While telomere length can be measured by telomere restriction fragment assay or quantitative PCR, these methods only provide the averaged telomere length. On the contrary, fluorescence in situ hybridization (FISH) can provide the information of the individual telomeres in cells. Here, we provide protocols and representative results of the method to determine telomere length of C. elegans by fluorescent in situ hybridization. This method provides a simple, but powerful, in situ procedure that does not cause noticeable damage to morphology. By using fluorescently labeled peptide nucleic acid (PNA) and digoxigenin-dUTP-labeled probe, we were able to visualize two different repetitive sequences: telomere repeats and template of ALT (TALT) in C. elegans embryos and gonads.
Telomeer beschermt chromosomale uiteinden van afwijkende fusion en degradatie. Zoogdieren telomeer is samengesteld uit G-rijke hexamere herhalingen, TTAGGG en shelterin complexen. De telomere repeat sequentie van de nematode is vergelijkbaar met die van zoogdieren (TTAGGC). De meeste eukaryoten gebruik maken van telomerase aan telomeer herhalingen toe te voegen aan hun chromosomale uiteinden. Echter, 10-15% van kankercellen gebruik telomerase onafhankelijk mechanisme, bekend als alternatieve Verlenging van Telomeren (ALT) 3. Eerder hebben we gemeld dat telomeer herhalingen en de bijbehorende sequenties, genoemd als Talt, werden versterkt in de telomeren van telomerase mutant lijnen die kritische steriliteit 2 overleefd.
Telomeerlengte werd gemeten door middel van kwantitatieve PCR of Southern blot, dat de gemiddelde lengte van telomeren totale 4,5,6,7 biedt. Lees telling van telomeer repeat in whole genome sequencing data is ook een indicator van de totale inhoud van telomeren 8. Hoewel Single telomeerlengte Analyse (STELA) kan over een lengte van een telomeer, kan geen ruimtelijke informatie telomeren 9 verschaffen. Terwijl POT-1 :: mCherry reportergen bevat de ruimtelijke informatie van telomeren in vivo, kan niet stukken dubbelstrengs telomeren vertegenwoordigen als POT-1 is een enkelstrengs telomeer eiwit 10.
Terwijl genoemde werkwijzen de gemiddelde informatie van repetitieve sequenties, fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) maakt het mogelijk om de hoeveelheid en ruimtelijke patroon van afzonderlijke sequenties van belang mbt een chromosomaal gebied. In plaats van zuivering van DNA, weefsels of cellen gefixeerd met de natuurlijke ruimtelijke informatie in FISH behouden. Zo FISH is een zowel kwantitatieve als kwalitatieve tool voor het observeren van de individuele herhaalde sequenties, zoals telomeer herhalingen.
Dit protocol verschaft een efficiënte werkwijze voor het gelijktijdig detecteren van zowel telolouter en andere repeats gebaseerd op verbeteringen van eerder beschreven methoden 11,12. C. elegans larven of volwassenen zijn meercellig organisme met zeer gedifferentieerde cellen. De heterogeniteit van cellen belemmert op de kwantitatieve analyse van een groot aantal telomere spots. Om het aantal geanalyseerde cellen te maximaliseren, embryo geïsoleerd en uitgespreid op de-polylysine gecoate glaasjes voor FISH. Bovendien kan dit protocol ook worden gecombineerd met immunofluorescentie.
Als bewijs dat het protocol werkt, wordt aangetoond dat het mogelijk is om te observeren en te kwantificeren twee verschillende repetitieve sequenties. DNA-probe tegen TALT1 werd gegenereerd met PCR eenvoudige integratie digoxigenine-dUTP. Dan is deze TALT1 probe en fluorescentie-gemerkte telomere PNA probe werden gelijktijdig gehybridiseerd. Vervolgens werd digoxigenine gedetecteerd door immunofluorescentie canonieke werkwijzen. Wij presenteren hier de vertegenwoordiger van de beelden, waar TALT1 colocalized met de telomeer in TRT-1 </em> overlevenden.
Het belangrijkste voordeel van ons protocol is de eenvoud van de procedure zonder merkbare schade aan de morfologie van celstructuur. Verschillende stappen werden geoptimaliseerd voor C. elegans FISH in dit protocol. De kritische stappen voor een succesvolle vissen omvatten etikettering van probes, fixatie van embryo's en penetratie. Digoxigenine-dUTP labeling methode biedt een eenvoudig te gebruiken methode labeling met behulp van PCR of nick-translatie. Om lange doelsequentie te labelen, is nick-translati…
The authors have nothing to disclose.
Mutant worm strains were kindly provided by the Caenorhabditis Genetics Center. This research was supported by a grant of the Korea Health Technology R&D Project through the Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), funded by the Ministry of Health & Welfare, Republic of Korea (grant number: HI14C1277).
PNA probe | PANAGENE | custom order | |
Anti-Digoxigenin-Fluorescein, Fab fragments | Roche | 11207741910 | use 1:200 diluted in PBST |
Digoxigenin-dUTP | Roche | 11573152910 | |
Bovine serum albumin | SIGMA-ALDRICH | A-7906 | |
Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | P-6148 | prepare 4% paraformaldehyde by heating in DW with few drops of NaOH. add 0.1 volume of 10x PBS. |
Vectashield | Vector Laboratories | H-1200 | |
Hybridizaiton solution | 3X SSC, 50% formamide, 10% (w/v) dextran sulfate, 50 ug/ml heparin, 100 ug/ml yeast tRNA , 100ug/ml sonicated salmon sperm DNA | ||
Hybridizaiton wash solution | 2X SSC, 50% formamide | ||
Formamide | BIONEER | C-9012 | toxic |
Methanol | Carlo Erba | ||
Acetone | Carlo Erba | ||
Heparin | SIGMA-ALDRICH | H3393 | make 10 mg/ml for stock solution |
Dextran sulfate | SIGMA-ALDRICH | 67578 | |
10X PBS | For 1 Liter DW : 80 g NaCl, 2.0 g KCl, 27 g Na2HPO4:7H2O, 2.4 g KH2PO | ||
PBST | 1X PBS, 0.1% tween-20 | ||
Polysorbate 20 | SIGMA-ALDRICH | P-2287 | Commercial name is Tween-20 |
Poly-L-Lysine solution (0.1 % w/v) | SIGMA-ALDRICH | P-8920 | prepare fresh 0.01 % w/v solution before use |
M9 | 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 L | ||
Bleaching solution | 20% sodium hypochlorite, 0.5 M KOH | ||
Antibody buffer | 1X PBST, 1mM EDTA, 0.1% BSA, 0.05% Sodium azide (toxic) | ||
Blocking solution | Antibody buffer with 5% bovine serum albumin (BSA) | ||
illustra Microspin G-50 | GE healthcare | 27-53310-01 | |
20X SSC | To make 1L, 175.3 g of NaCl, 88.2 g of sodium citrate, H2O to 1 L, adjust pH to 7.0 | ||
2X SSCT | 2X SSC, 0.1 % tween-20 | ||
10x digoxigenin-dUTP mix | 1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0.65mM dTTP, 0.35mM DIG-11-dUTP | ||
PCR purification columns | Cosmo genetech | CMR0112 | |
Glass cleaner / ULTRA CLEAN | Dukssan pure chemicals | 8AV721 | |
Multi-well glass slide | MP biomedicals | 96041205 | |
Nematode growth media | to make 1 L, 3 g of NaCl, 17 g of agar, 2.5 g of peptone, H2O to 974 mL. Autoclave and cool the flask. Add 1 mL of 1M CaCl2, 1 ml of 4 mg/mL cholesterol in ethanol, 1 ml of 1 M MgSO4, 25 mL of 1 M KPO4. | ||
Levamisole | SIGMA-ALDRICH | 196142 | |
Razor | Feather | blade No. 11 | |
Rnase A | Enzynomics | ||
BSA | SIGMA-ALDRICH | A7906 | |
Equipments | |||
Confocal microsope | Zeiss | LSM 510 | EC Plan-Neofluar 100x was used as objective lens. |
Dry block / aluminum block | Labtech | LBH-T03 | Set temperature to 80℃ |
Humid chamber | Plastic box filled with paper towel soaked in DW | ||
Image Analysis Software | Dr. Peter Landsdorp | TFL-telo | http://www.flintbox.com/public/project/502 |